RU486 un farmaco? o un veleno letale?

Così spiega monsignor Giulio Sgreccia l'immissione in commercio del farmaco Mifepristone, più comunemente chiamato RU486, la cosidetta "pillola abortiva". La chiesa infatti ritiene l'utilizzo di tale un delitto da scomunica. Il farmaco è gia utilizzato in altri paesi europei, e adesso arriva anche in Italia dopo delibera del consiglio di amministrazione dell'AIFA (Agenzia del farmaco). La pillola potrà essere utilizzata solo in ospedale entro il 49/o giorno di gravidanza, oltre questi limiti infatti le complicanze aumentano rispetto all'aborto chirurgico. L'aborto chimico infatto presenta le sue complicanze che possono talvolta portare alla morte del paziente come dimostrano i 29 casi di decesso. Si tratta di un ormone steroideo con azione anti progestinica; il progesterone è l'ormone che assicura il mantenimento della gravidanza, viene prodotto inizialmente dal corpo luteo il quale poi viene mantenuto intatto grazie all'intervento dell'HCG (Gonadotropina corionica umana) prodotta intorno al sesto giorno dopo la fecondazione e cioè all'incirca nella fase di annidamento nell'utero. L'HCG permane fino a che la produzione di progesterone non è sostituita da produzione placentare. L'RU486 legandosi al recettore nucleare del progesterone, entra in competizione con l'ormone provocando l'inibizione dell'azione dello stesso sui geni delle cellule uterine, bloccando lo sviluppo embrionale e causando il distacco e l'eliminazione della mucosa uterina in un processo simile a quello mestruale. Tale farmaco quindi impedendo l'annidamento è clinicamente utilizzato al fine di interruzioni di gravidanza terapautiche spesso accompagnato da un intervento secondario con introduzione di fattori luteinici come una Prostaglandina, che provoca la contrazione uterina, favorendo l'eliminazione della mucosa e dell'embrione.

TRIPANOSOMI AFRICANI: MAGHI DEL TRAVESTIMENTO

Molti avranno di sicuro sentito parlare almeno una volta della malattia del sonno (tripanosomiasi africana). Questa malattia è causata da un parassita, il protozoo flagellato Trypanosoma brucei, è un parassita del sangue veicolato dalla mosca tse-tse (specie di mosche appartenenti al genere della glossina). Una volta entrato nell'ospite l'infezione dovuta a questo parassita dura molto a lungo terminando con la morte dell'ospite. In realtà il protozoo viene ricosciuto dal sistema immunitario e ad ogni attacco la stragrande maggioranza di questi parassiti viene distrutta, ma una piccola parte riesce sempre a sopravvivere e a ripopolare il sangue mantenendo attiva l'infezione. Ciò avviene perchè questo microrganismo ha una grande capacità nel modificare rapidamente la proteina di rivestimento. Infatti ogni triposoma è rivestito da 10 milioni di molecole di una singola glicoproteina. Il sistema immunitario riconosce questa proteina di rivestimento, ma prima che tutti i triposomi siano uccisi alcuni riescono a cambiare la glicoproteina di superficie in un altra che non è immediatamente riconosciuta dal sistema immunitario, di conseguenza i parassiti proliferano nuovamente nel sangue. Questa storia si ripete varie volte e grazie a questa capacità il parassita riuscirà sempre a sopravvivere mantenendo l'infezione per settimane o anche mesi fino a quando l'ospite muore. La capacità del parassita di modificare le glicoproteine di superficie è dovuto alla presenza nel loro genoma di geni che codificano diverse varianti di queste glicoproteine, in ogni istante solo uno di questi geni è attivo mentre gli altri sono silenti. Questo fa si che durante la malattia, i geni che vengono espressi cambiano continuamente, facendo in modo che il parassita modifichi spesso le sue proteine di rivestimento, riuscendo così ad eludere il sistema immunitario.

PERCHE' NEL DNA RITROVIAMO LA TIMINA E NON URACILE?

Perchè a differenza dell'RNA nel DNA troviamo la timina (immagine sopra) al posto dell'uracile? In fondo entrambe si appaiano all'adenina. La risposta sta nel fatto che la timina contribuisce a garantire la fedeltà della replicazione. Nel DNA durante i processi della replicazione vengono commessi degli errori nella sintesi delle nuove catene polinucleotidiche complementari agli stampi; errori che vengono corretti dalle DNA polimerasi o da altri enzimi coinvolti nella riparazione degli errori. Una delle mutazioni più comuni è la deamminazione della citosina che porta a formare l'uracile. In ogni istante un piccolo numero di residui di citosine perde il suo gruppo amminico mediante deamminazione venendo così convertito in uracile.

Per fare un esempio: che cosa succederebbe se durante la replicazione una base di C-G si separasse? Se l'uracile fosse una base del DNA, in quel punto la citosina che è stata deamminata ad uracile si appaierebbe con una adenina piuttosto che con una guanina. Di conseguenza se l'uracile fosse una base comunemente presente nel DNA, le DNA polimerasi appaierebbero un'adenina in corrispondenza di un uracile, e non ci sarebbe modo di capire che la presenza dell'uracile è dovuta ad una mutazione, di conseguenza l'errore non sarebbe corretto. Poichè l'uracile non è una base naturale del DNA, le DNA polimerasi possono riconoscerla come un errore e sostituirla. Ecco perchè la timina, nonostante abbia come unica differenza strutturale dall'uracile la presenza di un gruppo metile al C-5, contribuisce ad assicurare che la replicazione del DNA avvenga in maniera efficiente.

DISTORSIONI DEL DNA: TWIST SLIDE ROLL

Qualche tempo fa abbiamo dato uno sguardo alla molecola del DNA e alle sue caratteristiche strutturali; bisogna sottolineare però che tutti i parametri della doppia elica descritti da Watson e Crick sono dei valori medi. E quando andiamo ad osservare una molecola di DNA con una particolare composizione possiamo avere dei valori leggermente diversi. Infatti possiamo notare delle distorsioni nella struttura della doppia elica, ed una delle distorsioni più comuni che si osservano è relativa alla curvatura del DNA definita angolo di twist. Il twist ha un valore medio intorno ai 36° come descritto da Watson e Crick, però questo valore può variare a seconda del tipo di basi azotate che incontriamo lungo la molecola. Come mostrato nel grafico sottostante si nota che nel passaggio A-A, e T,T l'angolo è di 36°mentre negli altri casi G,C e C,G l'angolo è di circa 40°.

Ciò significa che a seconda delle basi presenti, l'angolo di twist della doppia elica varia, variazione che dipende anche dall'inclinazione delle basi stesse. Infatti bisogna sottolineare che il twist permette un ottimo appaiamento tra le basi, ma non è ottimale per un buon impilamento delle basi stesse, e infatti questa distorsione potrebbe farci pensare che riduca la superficie di sovrapposizione delle basi azotate con conseguente perdita della stabilità della molecola, però vi sono anche altre deformazioni nella struttura del DNA che contribuiscono a ristabilire una impilazione migliore; tra queste deformazioni vi è il propeller twist detto comunemente distorsione a pala d'elica.

Come si può osservare nell'immagine le basi azotate non sono disposte proprio sullo stesso piano ma in due piani diversi (l'entità della distorsione può variare a seconda del tipo di basi) che si sovrappongono in modo tale da sembrare un elica. Questo tipo di rotazione permette un ottima sovrapposizione tra le basi azotate che si trovano al di sopra e al di sotto nella doppia elica. Inoltre si può notare che i legami idrogeno tra le due basi sono distorti ma rimangono ugualmente intatti, inoltre sono possibili anche legami idrogeno incrociati che stabilizzano la distorsione a pala d'elica. Oltre al twist si possono incontrare altri tipi di distorsioni piuttosto comuni (si possono vedere nell'immagine in cima alla pagina) come il roll, distorsione che determina l'inclinazione del piano di una coppia di basi azotate rispetto al piano della coppia successiva, senza variazione dell'inclinazione dei legami fosfoesterei, un pò come le pagine di un libro che si aprono, il tilt che determina un inclinazione del piano di una coppia di basi azotate rispetto al piano della coppia successiva. Questo tipo di deformazioni altro non sono che la risposta alle interazioni tra le basi azotate, insomma si creano per avere una migliore stabilità strutturale.

CHE COSA E' LA NUOVA INFLUENZA A(H1N1)?

L'OMS (Organizzazione mondiale della sanità) ha innalzato il livello di allerta a 6, più di 74 le nazioni colpite nel mondo, e casi di persone infettate dal virus A/H1N1 diventano ogni giorno di più. In questo link dell'OMS (NEW INFLUENZA A/H1N1) potete vedere una mappa che viene aggiornata continuamente, mostra i paesi dove si sono registrati casi di influenza A confermati da analisi di laboratorio. La mappa proviene direttamente dal sito dell'OMS aspettate qualche secondo dopo aver cliccato il link e si caricherà la pagina. Come dichiarato dalla direttrice dell'OMS Margaret Chan; la pandemia per ora ha una gravità moderata, e l'aver innalzato il livello di allerta a 6 non vuol dire che il virus sia diventato più aggressivo, ma dal momento che non è tamponabile bisogna mantenere alto lo stato di allerta. La gravità della pandemia potrebbe aumentare? Come dichiarato sempre dal sito dell'OMS, la gravità delle pandemie può cambiare nel tempo e la combinazione di determinati fattori potrebbe portare ad un aggravarsi dell'epidemia, ad esempio un ulteriore cambiamento del virus potrebbe favorire questo evento. Le ragioni che hanno spinto l'OMS a dichiarare la pandemia di gravità moderata è dovuto principalmente al fatto che:

1)Molte persone sono riuscite a guarire senza la necessità di essere ricoverate in ospedali

2)I sistemi di assistenza sanitaria dei paesi sono riusciti a far fronte senza troppe difficoltà ai casi

di influenza A.

Ma che cosa è questa nuova influenza A?

INFLUENZA A: L'OMS DICHIARA LO STATO DI PANDEMIA

Nuovi aggiornamenti riguardanti l'influenza A, oggi 11 giugno l'OMS (Organizzazione mondiale della sanità) a fronte dei tanti casi, dovuti al virus A/H1N1, che ormai sono arrivati a quota 28774, ha innalzato il livello di allerta a 6 dichiarando lo stato di pandemia. "E' la prima dal 1968", ha dichiarato Margaret Chan direttrice generale dell'organizzazione della sanità, la quale precisa che il nuovo virus, che ha causato oltre 28000 casi e 141 decessi, almeno nei primi periodi sarà di moderata gravità e il fatto di aver innalzato il livello di allerta a 6, non indica che il grado di pericolosità e aggressività del virus è aumentato, ma si vuole sottolineare che i paesi di tutto il mondo devono mantenere molto alte le difese, contro un virus che per ora non si riesce a contenere.

DA OGGI UN NUOVO ARRIVATO NELLA FAMIGLIA "BIOSPROJECT"

Oggi, in occasione della giornata mondiale dell’ambiente, abbiamo deciso di cimentarci in una nuova avventura in rete..
La biologia è passione, curiosità, voglia di scoprire noi stessi, ma non solo. E’ anche interesse e studio di tutto ciò che naturalmente circonda l’uomo.
Per questo motivo oggi nasce “BiosProject: Earth”, una piccola finestra sulla zoologia e la botanica.

Scopriremo insieme tante curiosità sulla vita di animali insoliti, approfondiremo alcune caratteristiche delle piante e parteciperemo alle iniziative a favore dell’ambiente.


Perché.. La Terra ha bisogno di noi! :)

INFLUENZA SUINA

In pochi i giorni i casi accertati di influenza suina sono saliti ad oltre 300; secondo quanto riportato dall'organizzazione mondiale della sanità (OMS ), la situazione continua ad evolversi rapidamente. Oggi 1 ° maggio 2009, 11 paesi hanno ufficialmente segnalato 331 casi di influenza dovuti al virus A (H1N1). Il governo degli Stati Uniti ha segnalato 109 casi umani confermati in laboratorio. Il Messico ha segnalato 156 casi umani confermati di infezione, di cui nove morti accertati. I seguenti paesi hanno segnalato casi di persone che hanno contratto il virus, tutti confermati da analisi di laboratorio - Austria (1), Canada (34), Germania (3), Israele (2), Paesi Bassi (1), Nuova Zelanda (3), Spagna (13), Svizzera ( 1) e il Regno Unito (8). Si è ritenuto prudente per coloro che sono malati di rinviare viaggi internazionali, e per le persone che sviluppano sintomi di rivolgersi al medico, in linea con l'orientamento da parte delle autorità nazionali. Inoltre l'OMS assicura nuovamente che non vi è alcun alcun rischio di infezione derivante dal consumo di carne di maiale ben cotta.

Per il momento in Italia non sembrano esserci problemi di alcun tipo, e i pochi casi sospetti si sono rivelati fortunatamente dei falsi allarmi.

Su google potete trovare una mappa che segnala i paesi dove sono stati registrati i contagi, basta cliccare su H1N1 swine flu . Per quanto riguarda la simbologia: Viola significa che vi è un caso probabile o confermato ; giallo sono casi risultati negativi, i decessi non sono riportati, mentre rosa sta ad indicare che sono in corso degli accertamenti.

ESTRAZIONE RNA

Le quantità di RNA variano a seconda dei tessuti e delle cellule che prendiamo in esame, per preparare l'RNA, come per il DNA genomico, si può partire da tessuti, dalle cellule, ma raramente dai nuclei, inoltre per estrarre l'RNA dobbiamo prendere in considerazione una serie di precauzioni. Uno dei problemi principali lo danno le RNAsi che sono enzimi un pò difficili da denaturare, resistono all’ebollizione prolungata, alla sterilizzazione in autoclave; sono attive entro un ampio range di pH, e inoltre a differenza delle DNAasi non basta aggiungere composti come l'EDTA, questo perchè le RNAsi funzionano senza necessità di cofattori enzimatici, o composti come il SDS, la struttura secondaria delle RNAsi sono in grado di ripiegarsi anche dopo essere state trattate con agenti denaturanti se l'agente è rimosso. Per cui prima di rompere le cellule si devono prendere della precauzioni, come preparare la vetreria prima di effettuare l'estrazione con NaOH o DPEC (dietlipirocarbonato) potente inibitore delle RNAsi; questo composto modifica i residui di istidina, fondamentali per l’attività catalitica. Dopo aver fatto questo le cellule vengono raccolte e centrifugate, in seguito il precipitato è raccolto e inserito in una soluzione di isotiocianato di guanidino composto che contribuisce ulteriormente ad inibire le RNasi (in realtà la sua funzione non è altamente specifica per le RNAsi ma probabilmente è abbastanza potente da denaturarle), poi si aggiunge EDTA che rompe le nucleasi (ma essendo un agente chelante che lega particolarmente bene gli ioni magnesio, calcio, zinco e rame e può denaturare anche altri enzimi) sarcosyl che rompe le membrane e il 2-mercaptoetanolo che denatura le proteine rompendo i ponti disolfurici indispensabili per il mantenimento della struttura delle RNAsi. A questo punto si omogenizza il tutto, si aggiunge sodio acetato a pH 4 fenolo saturo con acqua, cloroformio e alcool isoamilico, poi si agita e si centrifuga per eliminare le restanti proteine e il DNA. In ultimo si precipita l'RNA con alcol isopropilico e si incuba a -20°C. Dopo aver fatto questo si raccoglie il tutto nuovamente in isotiocianato di guanidina. Negli ultimi passaggi si è accennato all'utilizzo di fenolo, isotiocianato di guanidina, cloroformio utilizzati per denaturare le restanti proteine, alcuni di questi composti li abbiamo già accennati nell'estrazione di DNA plasmidico, perchè vengono utilizzati come denaturanti? Bisogna considerare che quello che determina la struttura e la funzionalità di una proteina è la sua specifica sequenza amminoacidica. Gli amminoacidi interagendo tra di loro formano una particolare struttura, che permette il corretto funzionamento della proteina; ma un ruolo importante nell'ambiente cellulare lo determina anche l'acqua che fa un pò da collante nel tenere la proteina nella sua corretta struttura, (ad esempio attraverso i legami idrogeno che si formano tra le molecole d'acqua, e, le catene laterali positive dei residui amminoacidici che costituiscono l'involucro esterno della proteina). Se cambiamo l'ambiente nel quale è immersa la nostra proteina aggiungendo fenolo o isotiocianato di guanidina avremo una modifica delle forze che sono presenti normalmente nell'ambiente cellulare, perchè andremo ad aggiungere differenti forze fra fenolo e i residui amminoacidi causando la denaturazione delle proteine. La concentrazione dell'RNA che abbiamo ottenuto dall'estrazione la si può leggere tramite la densità ottica in luce UV a 260 nm, possiamo controllare la qualità dell'RNA ottenuto tramite elettroforesi in gel d'agarosio in condizioni denaturanti con formaldeide. In sostanza se si sarà svolto tutto correttamente avremo 3 bande visibili, una di 28 Svedberg di rRNA, una di 18 Svedberg sempre di rRNA e una banda un pò più diffusa di 4 Svedberg di tRNA, la banda di mRNA non sarà molto visibile perchè nella cellula ce ne sta poco, costituisce infatti il 3-4% di RNA totale. L'RNA potrà essere visualizzato con Bromuro d'etidio che intercalandosi tra le basi fa evidenziare la posizione degli acidi nucleici quando sarà irradiato con luce UV. Ovviamente il 28 S ne assorbirà di più, se la banda 28 S dovesse risultare identica al 18 S significa che le RNAsi non sono state eliminate per bene e che parte dell'RNA è stato denaturato.

ESTRAZIONE DNA PLASMIDICO

I plasmidi sono piccole molecole di DNA extracromosomiale che nella tecnologia del DNA ricombinante possono essere utilizzate per introdurre frammenti di DNA di nostro interesse. Per preparare i plasmidi dobbiamo utilizzare necessariamente cellule che lo contengono, in questo caso i plasmidi li possiamo ricavare dai batteri. Sostanzialmente il dna plasmidico può essere estratto attraverso tre modalità: miniprep, midiprep, maxiprep; l'unica cosa che li differenza è la quantità di DNA plasmidico estratto, ma la modalità di estrazione è la stessa. Riassumiamo una miniprep, il protocollo completo è riportato nel post sopra (le immagini sono un pò piccole ma basta cliccarci sopra per ingrandirle). I batteri vengono fatti crescere in un terreno di coltura, e poi li raccogliamo tramite centrifugazione, il precipitato ottenuto viene poi sospeso in una soluzione di GTE (glucosio tris, EDTA) contenente l'enzima lisozima che causa la rottura della membrana batterica. Per la precisione questo enzima rompe i legami glicosidici tra il NAM (ac. N-acetilmuramico) e il NAG (N-acetilglucosammina) molecole che svolgono un ruolo di fondamentale importanza nella formazione del peptidoglicano, questo rende la cellula particolarmente suscettibile alla lisi, venendo a mancare una delle difese più importanti che il batterio ha a disposizione. Per provocare la lisi completa della cellula, la denaturazione delle proteine, l'idrolisi dell'RNA, si aggiungono alla sospensione SODA (carbonato di sodio), SDS, NaOH. La SODA serve a sciogliere tutto consentendo al SDS (sodio dodecil solfato) di esplicare la sua azione denaturante, intercalandosi tra i residui amminoacidici che costituiscono le proteine. E' da notare che l'aggiunta di SODA insieme ad un composto basico come NaOH o KOH provoca l'idrolisi dell'RNA ma non del DNA, questo perchè l'RNA come acido nucleico è costituito da ribonucleotidi, e a differenza dei deossiribonucleotidi che compongono il DNA, al carbonio 2 dello zucchero presenta un gruppo OH che lo rende particolarmente instabile in ambiente alcalino venendo idrolizzato in una miscela di nucleotidi 2,3-monofosfato, il DNA a differenza dell'RNA è più stabile in ambiente alcalino. A questo punto per ottenere la precipitazione di tutto quello che abbiamo denaturato e del DNA ad alto peso molecolare, si incuba il tutto a 4 gradi per 10 minuti, mediante aggiunta di potassio acetato, questo composto neutralizza il NaOH e la soluzione litica preparata precedentemente consentendo la precipitazione del DNA genomico. Si centrifuga a bassa velocità e si filtra il supernatante su garza per eliminare le proteine ed il DNA genomico. Si precipita il DNA plasmidico con alcool isopropilico, che ha la funzionalità di cambiare la costante dielettrica del mezzo quindi anche gli agganci degli OH con i ponti ad idrogeno e fa precipitare sia RNA che DNA, in parole povere l'alcool rende il DNA insolubile. Il pellet di centrifugazione si sospende in un tampone standard in TE (Tris= idrossimetilamminometano C4H11NO3; e EDTA= etilendiamminatetracetato) tampone con un pH intorno a 7,5-8,0; il Tris viene utilizzato in laboratorio per la preparazione di molti tamponi, mentre l'EDTA è un agente chelante, blocca le nucleasi che potrebbero danneggiare il DNA, distrugge l'attività catalitica di questi enzimi legando gli ioni magnesio che svolgono un ruolo estremamente importante nella funzionalità di tutti gli enzimi che svolgono attività catalitiche nei confronti del DNA; eliminandole si impedisce al DNA di nostro interesse di essere danneggiato. Al tampone si aggiungono poi CsCl, EtBr e si trasferisce tutto in una provetta per ultracentrifugazione. Si ultracentrifuga all'equilibrio e si recupera la banda del DNA plasmidico con una siringa il cui ago viene infilato lateralmente al tubo in corrispondenza della banda di DNA plasmidico che risulta fluorescente, posta tra una superiore di DNA genomico-batterico e una inferiore di RNA. Se durante la procedura il plasmide è stato danneggiato sul gradiente di cesio il plasmide avrà forma rilassata o lineare se il tutto è stato eseguito come si deve lo troveremo in forma superavvolta. A questo punto bisogna eliminare il bromuro d'etidio (EtBr) per pulire il DNA plasmidico e lo si fa mediante estrazione con alcol isoacetilico. A questo poi segue una dialisi contro TE per togliere il bromuro d'etidio e l'alcool. Si legge la soluzione in luce UV a 260 nm per misurare quanto DNA è stato ottenuto e a 280 nm per sapere se è privo di proteine. Infine possiamo verificare lo stato e la purezza del DNA estratto mediante elettroforesi in gel d'agarosio.

MARCATURA TERMINALE

Un'altra metodica è la marcatura terminale che consiste nel trattare il frammento di DNA o RNA sempre con un isotopo radioattivo (ad esempio fosforo 32 o 35). La marcatura è effettuata utilizzando un enzima adibito alla rimozione di un gruppo fosfato terminale all'estremità 5' la fosfatasi alcalina. In seguito il DNA privo dei gruppi fosfato all'estremità 5' sarà fosforilato con l'isotopo radioattivo da una polinucleotide chinasi un enzima che può catalizzare il trasferimento di un gruppo fosfato all'estremità 5' contenente il gruppo OH libero che è stato defosforilato dalla fosforilasi. In questo caso viene trasferito l'isotopo γ del fosforo 32 attaccato all'ATP (il fosfato terminale ad essere trasferito).
Ricapitolando; dalla molecola del DNA ad opera della fosfatasi alcalina vengono rimossi i gruppi fosfato terminali ...

5' P_________________________________________OH 3'
3' OH_________________________________________P 5'

... portando alla formazione di una doppia elica contenente alle estremità 3' e 5' solo gruppi OH...

5' HO_________________________________________OH3'
3' HO_________________________________________OH5'

...in seguito ad opera di una DNA chinasi l'isotopo radioattivo del fosforo viene trasferito dall'ATP alla molecola di DNA, marcandola radioattivamente con l'isotopo del fosforo.

5' P______________________________________OH 3'
3' HO__________________________________________P 5'

In seguito la reazione viene bloccata innalzando la temperatura. Se invece vogliamo marcare l'estremità 3' possiamo utilizzare l'enzima Terminal transfer; questo enzima catalizza l'aggiunta di circa 20-30 nucleotidi all'estremità 3'-OH di un filamento di DNA. Come substrati di questo enzima possono essere utilizzati nucleotidi come l'ATP contenente un isotopo radioattivo.

SOUTHERN BLOTTING

Qualche post fa abbiamo parlato delle endonucleasi di restrizione e di come questi enzimi tagliano il DNA legandosi a specifiche sequenze nucleotidiche di riconoscimento; i frammenti risultanti dai tagli possono essere esaminati attraverso l'elettroforesi sul gel d'agarosio che ci può essere di grande aiuto nell'individuare la grandezza dei frammenti ottenuti. A seconda della concentrazione del gel possiamo discriminare i frammenti di varia lunghezza arrivando addirittura a separare frammenti che differiscono anche per un solo nucleotide. In seguito il gel può essere immerso in bromuro d'etidio in modo tale da colorare il DNA una volta illuminato con luce ultravioletta. Questo tipo di risultato però lo possiamo ottenere solo con frammenti di DNA molto piccoli, infatti per frammenti di DNA più grandi non possiamo separare molecole di dimensioni simili, questo perchè se la molecola originale di DNA che abbiamo usato è molto lunga, darà origine a molti frammenti di restrizione e sul gel osserveremo un'unica grande banda diffusa, nella quale possono essere presenti frammenti di ogni grandezza.
Grazie alle tecniche di ibridizzazione, una banda corrispondente ad un determinato frammento di DNA (per esempio quello contenente un gene) può essere identificato e prelevato anche se non se ne conosce la grandezza attraverso la tecnica del southern blotting; a condizione però di conoscere almeno una parte della sequenza di nostro interesse. Vediamo dunque quali sono i passaggi attraverso i quali si esegue una southern blotting. Prima di tutto digeriamo il DNA con gli enzimi di restrizione che in seguito saranno sottoposti ad elettroforesi su gel d'agarosio che le discriminerà in base al peso molecolare; quando i frammenti saranno completamente separati per elettroforesi, il DNA può essere visualizzato immergendo il gel in bromuro d'etidio. Il gel può essere immerso anche in una soluzione di HCl 0,2 M per facilitare una blanda depurinazione (l'immersione però in HCl può essere facoltativo). Invece dopo queste fasi preparatorie il gel viene immerso in un alcale forte, molto spesso si utilizza una soluzione diluita di NaOH 0,5 M per denaturare il DNA, la funzione della base forte è quella di scindere la doppia elica in un DNA a singolo filamento, questo passagio sarà di fondamentale importanza, perchè consentirà in seguito di ibridare i frammenti di DNA con una sonda specifica. Nella tappa successiva attraverso un tampone con un pH specifico si porta il gel alla neutralità (bisogna neutralizzare l' NaOH). Il gel può essere immerso in una soluzione di SSC per creare un ambiente ad alta forza ionica. Nella tappa successiva il gel viene posto su un foglio di nitrocellulosa o di nylon dove una soluzione salina viene fatta passare attraverso il gel d'agarosio in direzione perpendicolare alla direzione elettroforetica. La soluzione salina viene estratta dal gel in vari modi:

1) elettroblotting

2) sfruttando la capillarità

3) attraverso aspirazione (blotting da vuoto). Il movimento della soluzione salina attraverso il gel permette al DNA di essere trasferito dal gel alla nitrocellulosa, la quale lega molto strettamente le molecole di DNA a singolo filamento immobilizzandole in maniera efficace sul filtro nelle identiche posizioni a quelle in cui si incontrano nel gel. Si noti che il legame tra la molecola del DNA e la nitrocellulosa sembra essere causato da una combinazione di legami ad idrogeno, interazioni idrofobiche e ponti salini. La nitrocellulosa in seguito viene asciugata, facendola disseccare in un forno a vuoto per evitare il contatto con l'ossigeno, che reagisce in maniera violenta con la nitrocellulosa distruggendola, inoltre l'essiccamento in forno a vuoto fissa maggiormente le molecole di DNA alla nitrocellulosa. Quest'ultima tappa viene definita di preibridizzazione, il foglio di nitrocellulosa viene incubato in un sacchetto con una soluzione contenente proteine (albumina serica) o un detergente come SDS 20%. La funzionalità di questa soluzione sarà quella di saturare tutti i rimanenti siti di legame per il DNA che si trovano sulla nitrocellulosa, in modo non specifico dell'altro DNA, insomma questa miscela ha lo scopo di evitando in questo modo degli appaiamenti aspecifici con il filtro stesso, la fase di preibridizzazione viene eseguita ponendo il filtro in una apposita busta sigillata nella quale viene pipettata con cautela la miscela di preibridizzazione, in seguito viene effettuato l'essiccamento ad una temperatura di 65°C per molte ore, circa 6-12. Per rilevare la presenza di una particolare molecola di DNA all'interno dello striscio elettroforetico comprendente moltissimi frammenti di DNA, nello stesso sacchetto utilizzato per la preibridizzazione viene inserita la miscela per la ibridizzazione contenente una soluzione con la sonda specifica. Una sonda è di solito una molecola di DNA a singolo filamento di sequenza definita, che è stata marcata con un isotopo radioattivo (come il P32) o con qualche altro marcatore facilmente rilevabile con metodiche tipo autoradiografia. Ovviamente la sequenza nucleotidica sarà complementare al frammento di DNA che stiamo cercando, la sonda di DNA a singolo filamento si appaierà a quello del DNA bersaglio formando una duplex ibrido, che marcherà il dna bersaglio rendendolo riconoscibile e rilevandone la posizione sul foglio di nitrocellulosa. La preparazione della sonda viene effettuata con la metodica della nick translation.

Bisogna tenere conto di alcuni fattori quando si utilizzano i filtri di nylon o di nitrocellulosa:

FILTRO DI NYLON: il legame degli acidi nucleici al filtro avviene tramite legami covalenti ed è duraturo. In genere il fissaggio viene eseguito a 70°C, in stufa o con alcali deboli, o utilizzando i raggi UV.

FILTRO DI NITROCELLULOSA: il filtro dopo essiccamento è fragile e non sopporta molti cicli di lavaggio e ibridazione.

RANDOM PRIMER

Il random primer è un'altra tecnica per la marcatura del DNA, consiste nel denaturare il DNA in singole eliche tramite bollitura e poi raffreddarlo rapidamente in ghiaccio. Primer di circa 6-8 nucleotidi vengono inseriti casualmente nel DNA. Ovviamente si andranno ad appaiare a sequenze complementari di DNA e questo avverrà in molte posizioni perchè saranno presenti tutti i tipi di nucleotidi. I primer saranno in seguito allungate dalla polimerasi di Klenow (DNA pol I priva dell'attività esonucleasica 5'-3') per evitare che gli stessi primer possano essere distrutti dalla stessa polimerasi. I primer sono dNTP marcati sempre con un isotopo radioattivo in genere con l'isotopo 32 o 35 del fosforo. A differenza della nick traslation questa tecnica può essere usata solo partendo da pochi residui nucleotidici di DNA. (per vedere meglio l'immagine cliccateci sopra che si ingrandisce)