SOUTHERN BLOTTING

Qualche post fa abbiamo parlato delle endonucleasi di restrizione e di come questi enzimi tagliano il DNA legandosi a specifiche sequenze nucleotidiche di riconoscimento; i frammenti risultanti dai tagli possono essere esaminati attraverso l'elettroforesi sul gel d'agarosio che ci può essere di grande aiuto nell'individuare la grandezza dei frammenti ottenuti. A seconda della concentrazione del gel possiamo discriminare i frammenti di varia lunghezza arrivando addirittura a separare frammenti che differiscono anche per un solo nucleotide. In seguito il gel può essere immerso in bromuro d'etidio in modo tale da colorare il DNA una volta illuminato con luce ultravioletta. Questo tipo di risultato però lo possiamo ottenere solo con frammenti di DNA molto piccoli, infatti per frammenti di DNA più grandi non possiamo separare molecole di dimensioni simili, questo perchè se la molecola originale di DNA che abbiamo usato è molto lunga, darà origine a molti frammenti di restrizione e sul gel osserveremo un'unica grande banda diffusa, nella quale possono essere presenti frammenti di ogni grandezza.
Grazie alle tecniche di ibridizzazione, una banda corrispondente ad un determinato frammento di DNA (per esempio quello contenente un gene) può essere identificato e prelevato anche se non se ne conosce la grandezza attraverso la tecnica del southern blotting; a condizione però di conoscere almeno una parte della sequenza di nostro interesse. Vediamo dunque quali sono i passaggi attraverso i quali si esegue una southern blotting. Prima di tutto digeriamo il DNA con gli enzimi di restrizione che in seguito saranno sottoposti ad elettroforesi su gel d'agarosio che le discriminerà in base al peso molecolare; quando i frammenti saranno completamente separati per elettroforesi, il DNA può essere visualizzato immergendo il gel in bromuro d'etidio. Il gel può essere immerso anche in una soluzione di HCl 0,2 M per facilitare una blanda depurinazione (l'immersione però in HCl può essere facoltativo). Invece dopo queste fasi preparatorie il gel viene immerso in un alcale forte, molto spesso si utilizza una soluzione diluita di NaOH 0,5 M per denaturare il DNA, la funzione della base forte è quella di scindere la doppia elica in un DNA a singolo filamento, questo passagio sarà di fondamentale importanza, perchè consentirà in seguito di ibridare i frammenti di DNA con una sonda specifica. Nella tappa successiva attraverso un tampone con un pH specifico si porta il gel alla neutralità (bisogna neutralizzare l' NaOH). Il gel può essere immerso in una soluzione di SSC per creare un ambiente ad alta forza ionica. Nella tappa successiva il gel viene posto su un foglio di nitrocellulosa o di nylon dove una soluzione salina viene fatta passare attraverso il gel d'agarosio in direzione perpendicolare alla direzione elettroforetica. La soluzione salina viene estratta dal gel in vari modi:

1) elettroblotting

2) sfruttando la capillarità

3) attraverso aspirazione (blotting da vuoto). Il movimento della soluzione salina attraverso il gel permette al DNA di essere trasferito dal gel alla nitrocellulosa, la quale lega molto strettamente le molecole di DNA a singolo filamento immobilizzandole in maniera efficace sul filtro nelle identiche posizioni a quelle in cui si incontrano nel gel. Si noti che il legame tra la molecola del DNA e la nitrocellulosa sembra essere causato da una combinazione di legami ad idrogeno, interazioni idrofobiche e ponti salini. La nitrocellulosa in seguito viene asciugata, facendola disseccare in un forno a vuoto per evitare il contatto con l'ossigeno, che reagisce in maniera violenta con la nitrocellulosa distruggendola, inoltre l'essiccamento in forno a vuoto fissa maggiormente le molecole di DNA alla nitrocellulosa. Quest'ultima tappa viene definita di preibridizzazione, il foglio di nitrocellulosa viene incubato in un sacchetto con una soluzione contenente proteine (albumina serica) o un detergente come SDS 20%. La funzionalità di questa soluzione sarà quella di saturare tutti i rimanenti siti di legame per il DNA che si trovano sulla nitrocellulosa, in modo non specifico dell'altro DNA, insomma questa miscela ha lo scopo di evitando in questo modo degli appaiamenti aspecifici con il filtro stesso, la fase di preibridizzazione viene eseguita ponendo il filtro in una apposita busta sigillata nella quale viene pipettata con cautela la miscela di preibridizzazione, in seguito viene effettuato l'essiccamento ad una temperatura di 65°C per molte ore, circa 6-12. Per rilevare la presenza di una particolare molecola di DNA all'interno dello striscio elettroforetico comprendente moltissimi frammenti di DNA, nello stesso sacchetto utilizzato per la preibridizzazione viene inserita la miscela per la ibridizzazione contenente una soluzione con la sonda specifica. Una sonda è di solito una molecola di DNA a singolo filamento di sequenza definita, che è stata marcata con un isotopo radioattivo (come il P32) o con qualche altro marcatore facilmente rilevabile con metodiche tipo autoradiografia. Ovviamente la sequenza nucleotidica sarà complementare al frammento di DNA che stiamo cercando, la sonda di DNA a singolo filamento si appaierà a quello del DNA bersaglio formando una duplex ibrido, che marcherà il dna bersaglio rendendolo riconoscibile e rilevandone la posizione sul foglio di nitrocellulosa. La preparazione della sonda viene effettuata con la metodica della nick translation.

Bisogna tenere conto di alcuni fattori quando si utilizzano i filtri di nylon o di nitrocellulosa:

FILTRO DI NYLON: il legame degli acidi nucleici al filtro avviene tramite legami covalenti ed è duraturo. In genere il fissaggio viene eseguito a 70°C, in stufa o con alcali deboli, o utilizzando i raggi UV.

FILTRO DI NITROCELLULOSA: il filtro dopo essiccamento è fragile e non sopporta molti cicli di lavaggio e ibridazione.