lunedì 23 marzo 2009

NICK TRANSLATION


Con il termine sonda intendiamo un frammento di DNA o RNA che viene sintetizzato utilizzando alcuni isotopi radioattivi, ad esempio sintetizzando chimicamente deossiribonucleotidi contenenti isotopi del fosforo (isotopi 32 o 35). Le modalità attraverso le quali possiamo marcare con una sonda il DNA sono varie; abbiamo la marcatura terminale 5' che viene effettuata utilizzando una polinucleotidche chinasi, marcatura terminale 3' effettuata utilizzando la terminal transferasi, e il random primer. Oggi parliamo della nick traslation, con questa tecnica possiamo marcare il DNA in tutta la sua lunghezza, a tale scopo possiamo sfruttare enzimi come la DNAsi I (endonucleasi) e la DNA pol I, il processo può essere descritto semplicemente suddividendolo in due stadi:

I) Nella prima parte la DNAsi I causa una rottura interna alla molecola di DNA da marcare rompendo i legami 3'-5' fosfodiesterico e quindi causando una interruzione (nick)

II) In seguito si aggiunge alla miscela di reazione la DNA pol I con i dNTP (deossinucleosidi trifosfati) marcati con l'isotopo radioattivo del fosforo (32 o 35). La DNA pol I contenente attività esonucleasica 5'-3' rimuove tutte le basi nucleotidiche non marcate sostituendole con i deossinucleotidi contenenti gli isotopi radioattivi. Il risultato finale sarà una doppia elica marcata con una elevata % di isotopi radioattivi.
Se vogliamo fermare la reazione lo possiamo fare aggiungendo TE + SDS (tris EDTA= Etilendiammina tetracetato) che causa la denaturazione della miscela enzimatica. Qui di seguito è presente un link che vi mostra come avviene la la marcatura del DNA con questo metodo, basta cliccare avanti per vedere i vari passaggi del processo.

4 commenti:

  1. Il link non funziona

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  2. Grazie per avermelo fatto notare, l'ho sostituito con un immagine che descrive il funzionamento.

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  3. Vorrei sapere come mai la marcatura non riguarda mai il fosfato beta?

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  4. le metodiche di marcatura del DNA possono essere suddivise in marcatura interna (come nel nick translation) e marcatura esterna. Nel nick translation, durante l'inserimento del nucleotide marcato radioattivamente solo il fosfato in alfa viene coinvolto nella formazione del legame fosfoestereo, il fosfato in beta o in gamma viene espulso. Sinceramente non so dirti se riescano ad impedire l'inserimento in posizione beta del fosforo radioattivo durante la marcatura. In ogni caso sia nei processi definiti di marcatura interna, che in quelli di marcatura esterna il fosfato coinvolto è sempre l'alfa o il gamma. Quindi qualora si formasse anche un dNTP marcato in beta esso non svolgerebbe legami con la molecola di DNA da marcare.
    Spero di esserti stato d'aiuto, in ogni caso pubblicherò un post per chiarire le reazioni che avvengono in questo tipo di metodiche.
    Ciao.

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