Il random primer è un'altra tecnica per la marcatura del DNA, consiste nel denaturare il DNA in singole eliche tramite bollitura e poi raffreddarlo rapidamente in ghiaccio. Primer di circa 6-8 nucleotidi vengono inseriti casualmente nel DNA. Ovviamente si andranno ad appaiare a sequenze complementari di DNA e questo avverrà in molte posizioni perchè saranno presenti tutti i tipi di nucleotidi. I primer saranno in seguito allungate dalla polimerasi di Klenow (DNA pol I priva dell'attività esonucleasica 5'-3') per evitare che gli stessi primer possano essere distrutti dalla stessa polimerasi. I primer sono dNTP marcati sempre con un isotopo radioattivo in genere con l'isotopo 32 o 35 del fosforo. A differenza della nick traslation questa tecnica può essere usata solo partendo da pochi residui nucleotidici di DNA. (per vedere meglio l'immagine cliccateci sopra che si ingrandisce)
le applicazioni?
RispondiEliminaCiao Fra. E'una tecnica di marcatura del DNA, utilizzata per individuare un frammento o una sequenza di nostro interesse. Ad esempio può essere utilizzata per tecniche come il southern blot, quando si deve marcare il DNA radioattivamente.
RispondiEliminama è per costruire una sonda marcando il dna con un radioattivo o serve per marcare un dna o frammento di nostro interesse?
RispondiEliminaMi rendo conto che ciò che ho scritto nel commento precedente può dare luogo a confusione. La sonda di DNA è un frammento di DNA marcato radioattivamente. Le sonde sono poi utilizzate per legare sequenze di DNA che sono ad essa complementari. Il random primer è una tecnica di marcatura e come descritto nel post viene utilizzata per marcare le sequenze di DNA di nostro interesse. Può essere utilizzata per tecniche come il Southern blot, per individuare il DNA fissato sulla nitrocellulosa.
RispondiEliminascusa il ritardo, grazie mille :)
RispondiEliminaSpero di esserti stato d'aiuto in qualche modo. ciao
RispondiEliminaCiao, ho notato dalla figura che sono i dNTPs a essere marcati, non i primer. Verificando altrove ho avuto la conferma. Per il resto ottima spiegazione.
RispondiEliminaI primer sono i dNTP...
RispondiEliminascusate ma mi sfugge una cosa però: se è vero che serve per marcare sequenze di nostro interesse (infatti mi pare di capire sia una tecnica usata per evidenziare un dna di cui non conosco la sequenza), come faccio una volta marcate a capire quali esse sono? Ovvero: il melting avviene per tutto il Dna e essendo i primer generati casualmente io non conosco nemmeno la loro sequenza. Ora essi si legheranno in maniera generalizzata sul dna, la DnaPol inserisce i dNTP marcandolo radioattivamente ecc... e ora? Tutto il dna risulta marcato... come faccio a individuare il gene di interesse?
RispondiEliminaGrazie mille!