ENZIMI DI RESTRIZIONE

La tecnologia del DNA ricombinante ha svolto un ruolo di fondamentale importanza nel permettere un rapido sviluppo delle conoscenze su come avveniva l'espressione genica, la sua importanza sta nell'utilizzare enzimi che ci permettono di modificare il DNA in provetta. Gli enzimi che si possono sfruttare sono gli stessi che si trovano nelle cellule viventi e che partecipano a molti processi a carico del DNA.

DNA POLIMERASI: enzimi che partecipano ai processi della replicazione del DNA.

NUCLEASI: enzimi in grado di degradare il DNA rompendo i legami fosfodiesterici tra residui nucleotidici adiacenti.

LIGASI: enzimi capaci di legare, attraverso legami fosfodiesterici, estremità di molecole di DNA o porzioni interne di DNA dove sono presenti delle interruzioni.

Oggi parliamo degli enzimi di restrizione (nucleasi), per la precisione parleremo delle endonucleasi di restrizione, che svolgono un ruolo importante in tutti gli aspetti della tecnologia del dna ricombinante, la funzionalità di questi enzimi, ad esempio nei procarioti, è di proteggere la cellula dall'ingresso di materiale genetico estraneo, come quando la cellula procariotica è infettata da un virus batterico (batteriofago), se questi particolari enzimi riconoscono l'acido nucleico estraneo lo degradano. Le endonucleasi di restrizione come accennato prima sono in grado di rompere i legami fosfodiesterici tra due residui nucleotidici adiacenti idrolizzandoli, lo fanno riconoscendo specifiche sequenze di nucleotidiche ed effettuando tagli sulla doppia elica. Possiamo distinguere almeno tre tipi di nucleasi di restrizione definite anche di tipo I-II-III. Gli enzimi I e III non vengono utilizzati come gli enzimi di classe II perchè possono effettuare tagli anche a parecchie coppie di basi dal sito di riconoscimento, quindi non risultano molto utili essendo poco specifici nel taglio, di conseguenza non è possibile conoscere con certezza la posizione del taglio e le frequenze dei tagli. Gli enzimi di classe II sono molto più specifici tagliando proprio sulla specifica sequenza di riconoscimento o comunque molto vicina ad essa, essendo molto specifiche nel taglio generano una serie di frammenti la cui sequenza può essere predetta se si conosce la sequenza iniziale. Nella foto abbiamo un classico esempio di nucleasi di restrizione EcoRI (enzima isolato dall'E.Coli), questo enzima taglia il DNA solo ed esclusivamente sulla sequenza di sei nucleotidi 5'-GAATTC-3'; la quantità di segmenti di DNA che si possono ricavare utilizzando questi enzimi dipende da quante volte la sequenza di riconoscimento è presente nel DNA. Alcuni di questi enzimi possono tagliare il doppio filamento in due modi diversi, in posizione simmetrica (vedere nell'immagine AluI) portando alla formazione di estremità definite non coesive o piatte, altri tagliano il doppio filamento in maniera asimmetrica portando alla formazione di estremità definite coesive in quanto il taglio eseguito dall'enzima è sfalsato (vd. EcoRI o BamHI), lasciando le estremità 5' più lunghe di quelle 3'. Gli enzimi che portano alla formazione di questi tagli sono molto utili in quanto i filamenti sfalsati possono permettere l'inserimento di frammenti di DNA a doppio filamento che presentano estremità coesive complementari a quelle ottenute con gli enzimi di restrizione. Nel filmato preso da you tube (scusate è in inglese) potete vedere un esempio di quanto detto nelle ultime righe, argomento che comunque approfondiremo a breve.

E' possibile calcolare la lunghezza media dei frammenti prodotti da ogni enzima di restrizione e poi utilizzare questa informazione per stimare in maniera approssimativa il numero e la distribuzione dei siti di restrizione presenti nel genoma di nostro interesse. Per poter effettuare queste analisi partiamo da due assunzioni semplici: 1) ognuna delle 4 basi è presente nelle stesse proporzioni, come se il genoma fosse formato da 25% A, 25%T, 25% C, 25% G; 2) le basi sono distribuite in modo casuale lungo il DNA. Anche se queste assunzioni non sono sempre valide ci permettono di determinare la distanza media tra i siti di restrizione di qualunque lunghezza, usando la formula generale 4^n dove n è il numero di basi del sito. A sua volta il numero delle basi del sito può condizionare la lunghezza dei frammenti di restrizione, infatti secondo la formula 4^n, enzimi come RsaI, che riconosce la sequenza di 4 basi GTAC, taglia all'incirca una volta ogni 4^4, cioè 256 coppie di basi creando frammenti lunghi 256bp. In confronto l'enzima EcoRI, per un determinato perido di tempo, che riconosce la sequenza di 6 coppie di basi GAATTC, taglierà in media ogni 4^6, cioè 4096 coppie di basi dato che 1000 coppie di basi = 1 kilobase. Ora esponendo il DNA all'enzima per un tempo sufficientemente lungo si dà la possibilità di digerire estesamente il DNA. Il risultato è una digestione completa dove il DNA è tagliato al livello di tutti i siti possibili. Ma che succede se invece i ricercatori hanno di frammenti di 20 kb? La risposta è una digestione parziale che si ottiene dosando la quantità di enzima o il tempo in cui il DNA è esposto all'enzima stesso. Per esempio se andiamo a sottoporre il DNA a digestione con EcoRI, per un determinato periodo di tempo, permettendogli di tagliare all'incirca un sito di restrizione su 5, si producono frammenti lunghi in media 20kb. Insomma più lungo è il tempo di digestione maggiore sarà la percentuale dei siti di restrizione digeriti. Abbiamo accennato che l'enzima di restrizione RsaI che riconosce una sequenza di 4bp, taglia il genoma più o meno ogni 256 bp. Se per esempio esponessimo il genoma umano con le sue circa 3 miliardi di coppie di basi, a RsaI per un tempo sufficiente e in appropriate condizioni, potremmo stare certi che tutti i siti di restrizione saranno tagliati e otterremo: 3.000.000.000bp/256bp= all'incira 12.000.000bp (una media di 256bp). In confronto, EcoRI, il cui sito di restrizione è lungo 6bp taglia il DNA più o meno ogni 4096 bp. Se esponessimo chiaramente più lungo è il sito di riconoscimento di quell'enzima e minore sarà il numero di frammenti di restrizione ottenuti. Dopo aver ottenuto i frammenti li possiamo distinguere l'uno dall'altro in base al peso molecolare grazie all'elettroforesi su gel d'agarosio.