MARCATURA TERMINALE

Un'altra metodica è la marcatura terminale che consiste nel trattare il frammento di DNA o RNA sempre con un isotopo radioattivo (ad esempio fosforo 32 o 35). La marcatura è effettuata utilizzando un enzima adibito alla rimozione di un gruppo fosfato terminale all'estremità 5' la fosfatasi alcalina. In seguito il DNA privo dei gruppi fosfato all'estremità 5' sarà fosforilato con l'isotopo radioattivo da una polinucleotide chinasi un enzima che può catalizzare il trasferimento di un gruppo fosfato all'estremità 5' contenente il gruppo OH libero che è stato defosforilato dalla fosforilasi. In questo caso viene trasferito l'isotopo γ del fosforo 32 attaccato all'ATP (il fosfato terminale ad essere trasferito).
Ricapitolando; dalla molecola del DNA ad opera della fosfatasi alcalina vengono rimossi i gruppi fosfato terminali ...

5' P_________________________________________OH 3'
3' OH_________________________________________P 5'

... portando alla formazione di una doppia elica contenente alle estremità 3' e 5' solo gruppi OH...

5' HO_________________________________________OH3'
3' HO_________________________________________OH5'

...in seguito ad opera di una DNA chinasi l'isotopo radioattivo del fosforo viene trasferito dall'ATP alla molecola di DNA, marcandola radioattivamente con l'isotopo del fosforo.

5' P______________________________________OH 3'
3' HO__________________________________________P 5'

In seguito la reazione viene bloccata innalzando la temperatura. Se invece vogliamo marcare l'estremità 3' possiamo utilizzare l'enzima Terminal transfer; questo enzima catalizza l'aggiunta di circa 20-30 nucleotidi all'estremità 3'-OH di un filamento di DNA. Come substrati di questo enzima possono essere utilizzati nucleotidi come l'ATP contenente un isotopo radioattivo.