ESTRAZIONE RNA

Le quantità di RNA variano a seconda dei tessuti e delle cellule che prendiamo in esame, per preparare l'RNA, come per il DNA genomico, si può partire da tessuti, dalle cellule, ma raramente dai nuclei, inoltre per estrarre l'RNA dobbiamo prendere in considerazione una serie di precauzioni. Uno dei problemi principali lo danno le RNAsi che sono enzimi un pò difficili da denaturare, resistono all’ebollizione prolungata, alla sterilizzazione in autoclave; sono attive entro un ampio range di pH, e inoltre a differenza delle DNAasi non basta aggiungere composti come l'EDTA, questo perchè le RNAsi funzionano senza necessità di cofattori enzimatici, o composti come il SDS, la struttura secondaria delle RNAsi sono in grado di ripiegarsi anche dopo essere state trattate con agenti denaturanti se l'agente è rimosso. Per cui prima di rompere le cellule si devono prendere della precauzioni, come preparare la vetreria prima di effettuare l'estrazione con NaOH o DPEC (dietlipirocarbonato) potente inibitore delle RNAsi; questo composto modifica i residui di istidina, fondamentali per l’attività catalitica. Dopo aver fatto questo le cellule vengono raccolte e centrifugate, in seguito il precipitato è raccolto e inserito in una soluzione di isotiocianato di guanidino composto che contribuisce ulteriormente ad inibire le RNasi (in realtà la sua funzione non è altamente specifica per le RNAsi ma probabilmente è abbastanza potente da denaturarle), poi si aggiunge EDTA che rompe le nucleasi (ma essendo un agente chelante che lega particolarmente bene gli ioni magnesio, calcio, zinco e rame e può denaturare anche altri enzimi) sarcosyl che rompe le membrane e il 2-mercaptoetanolo che denatura le proteine rompendo i ponti disolfurici indispensabili per il mantenimento della struttura delle RNAsi. A questo punto si omogenizza il tutto, si aggiunge sodio acetato a pH 4 fenolo saturo con acqua, cloroformio e alcool isoamilico, poi si agita e si centrifuga per eliminare le restanti proteine e il DNA. In ultimo si precipita l'RNA con alcol isopropilico e si incuba a -20°C. Dopo aver fatto questo si raccoglie il tutto nuovamente in isotiocianato di guanidina. Negli ultimi passaggi si è accennato all'utilizzo di fenolo, isotiocianato di guanidina, cloroformio utilizzati per denaturare le restanti proteine, alcuni di questi composti li abbiamo già accennati nell'estrazione di DNA plasmidico, perchè vengono utilizzati come denaturanti? Bisogna considerare che quello che determina la struttura e la funzionalità di una proteina è la sua specifica sequenza amminoacidica. Gli amminoacidi interagendo tra di loro formano una particolare struttura, che permette il corretto funzionamento della proteina; ma un ruolo importante nell'ambiente cellulare lo determina anche l'acqua che fa un pò da collante nel tenere la proteina nella sua corretta struttura, (ad esempio attraverso i legami idrogeno che si formano tra le molecole d'acqua, e, le catene laterali positive dei residui amminoacidici che costituiscono l'involucro esterno della proteina). Se cambiamo l'ambiente nel quale è immersa la nostra proteina aggiungendo fenolo o isotiocianato di guanidina avremo una modifica delle forze che sono presenti normalmente nell'ambiente cellulare, perchè andremo ad aggiungere differenti forze fra fenolo e i residui amminoacidi causando la denaturazione delle proteine. La concentrazione dell'RNA che abbiamo ottenuto dall'estrazione la si può leggere tramite la densità ottica in luce UV a 260 nm, possiamo controllare la qualità dell'RNA ottenuto tramite elettroforesi in gel d'agarosio in condizioni denaturanti con formaldeide. In sostanza se si sarà svolto tutto correttamente avremo 3 bande visibili, una di 28 Svedberg di rRNA, una di 18 Svedberg sempre di rRNA e una banda un pò più diffusa di 4 Svedberg di tRNA, la banda di mRNA non sarà molto visibile perchè nella cellula ce ne sta poco, costituisce infatti il 3-4% di RNA totale. L'RNA potrà essere visualizzato con Bromuro d'etidio che intercalandosi tra le basi fa evidenziare la posizione degli acidi nucleici quando sarà irradiato con luce UV. Ovviamente il 28 S ne assorbirà di più, se la banda 28 S dovesse risultare identica al 18 S significa che le RNAsi non sono state eliminate per bene e che parte dell'RNA è stato denaturato.