IL CLONAGGIO DEL DNA

I genomi di animali, piante e microrganismi sono troppo grandi per essere analizzati con tecniche di laboratorio come gli enzimi di restrizione e l'elettroforesi su gel che ci forniscono un metodo per analizzare semplici molecole di DNA. Nei post precedenti abbiamo descritto come si misura la lunghezza dei frammenti di restrizione; se prendiamo ad esempio il genoma dell'Escherichia coli, costituito da circa 4200 kb, la digestione di questo genoma con l'enzima di restrizione EcoRI produrrebbe all'incirca 1000 frammenti e come abbiamo, quello umano circa 700 000 diversi frammenti. Insomma il punto è che se noi sottoponessimo questi frammenti all'analisi elettroforetica quello che osserveremmo non sarebbero delle bande distinte ma uscirebbe una strisciata (smear) difficile da interpretare. Ecco allora che per analizzare ogni frammento è necessario prima di tutto purificarli uno a uno e poi amplificarli, cioè produrre molte copie identiche di ogni singolo frammento purificato. Vi sono due tecniche che consentono di portare a termine questo compito: 1) è il clonaggio del dna con cui vengono amplificati frammenti di dna. 2) La PCR con cui si può purificare e amplificare frammenti di DNA di nostro interesse più velocemente di quanto si possa fare con il clonaggio del DNA.

Come funziona il clonaggio del DNA?

Il processo può essere suddiviso in varie tappe:

PRP: funziona?

Nel corrente numero della rivista scientifica Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons si torna a parlare di PRP.

Forse vi chiederete cos'è il "PRP"?

PRP sta per Platelet-rich plasma cioè letteralmente plasma ricco di piastrine.

Le pistrine sono piccoli frammenti cellulari contenute nel sangue periferico ricche di granuli. L'azione "terapeutica" del PRP risiede proprio nei numerosi fattori di crescita (growth factors) contenuti nei granuli piastrinici (vedi immagine).

Viene usato già dalla fine degli anni '90 in chirurgia maxillofacciale e in chirurgia plastica, ma di recente è cresciuto il suo utilizzo anche nella medicina dello sport.

Come funziona il PRP?

L'uso del PRP in chirurgia maxillo facciale e plastica deriva dal fatto che sembra migliorare la guarigione delle ferite e degli innesti ossei, e i recenti studi in vitro suggeriscono che migliori anche la guarigione di tendini e muscoli.

Da qui l'uso come metodo alternativo nel trattamento di alcuni comuni condizioni mediche legate alla pratica sportiva come il gomito del tennista (tennis elbow), tendinopatie della cuffia dei rotatori, il ginocchio del saltatore (Jumper's Knee) o le infiammazioni del tendine d'Achillle.

Come si prepara il PRP?

Il plasma ricco di piastrine si ottiene molto semplicemente: dopo aver effettuato un prelievo di sangue venoso del paziente, basta centrifugare la provetta a bassa velocità. Questa procedura separa le piastrine, i frammenti cellulari più leggeri, dai globuli rossi e bianchi, più pesanti. A questo punto si preleva il liquido contenuto nella porzione superiore della provetta e si ottiene un concentrato piastrinico pronto per essere iniettato nell'area danneggiata.

L'utilizzo del PRP è notevolmente aumentato negli ultimi anni proprio perchè il processo è semplice, veloce (circa 30 minuti dal prelievo di sangue all'iniezione di PRP autologo) e relativamente sicuro per il paziente. Esistono sempre rischi di infezione connessi all'iniezione e alcuni hanni pazienti hanno riportato un aumento del dolore e dell'infiammazione al sito di iniezione, ciononostante i rischi di effetti collaterali per il singolo paziente appaiono minimi.

Nonostante i dati a disposizione siano ancora scarsi, i primi risultati appaiono promettenti: sembra che il PRP migliori il processo di guarigione! Ad oggi ciò ancora non è stato dimostato, ma la buona notizia è che sono in corso un gran numero di studi che nei prossimi anni sveleranno i reali benefici del PRP.

CISTINOSI: novità nella lotta alla malattia.

La Cistinosi è una rara malattia autosomica recessiva. La malattia è causata da un accumulo di un amminoacido la cisteina. Gli aminoacidi sono molecole organiche che, legate insieme, formano le proteine, macromolecole di fondamentale importanza per la funzionalità dele cellule. La loro scomposizione avviene nei lisosomi. La cistinosi compare quando il sistema di trasporto della cistina fuori dai lisosomi non funziona, provocando un accumulo di cistina all’interno delle cellule dell’organismo, tutto ciò causa un cattivo funzionamento della maggior parte degli organi. I primi organi ad essere colpiti sono i reni e gli occhi, successivamente sono interessati anche tiroide, fegato, muscoli, pancreas e sistema nervoso centrale.
Ebbene da La Jolla, CA - in data 17 settembre 2009 - arriva una notizia che forse può dare una speranza su una possibile cura che un giorno potrebbe essere creata.

DNA JUNK: scienziati scoprono che può essere estremamente utile nella terapia genica

Viene reso noto che degli scienziati dell'università di Edimburgo hanno identificato come una proteina permetta a sezioni di DNA junk (spazzatura) di essere tagliato e incollato nel codice genetico - una scoperta che potrebbe accelerare lo sviluppo di terapie geniche. Lo studio condotto da ricercatori dell'Università di Edimburgo, getta luce sul processo, noto a molti come trasposizione del DNA, in cui i geni che vengono spostati possono avere un effetto significativo sul comportamento dei geni vicini. Nel genoma umano, il riarrangiamento dei geni degli anticorpi ad esempio può attivare il sistema immunitario ad essere indirizzato più efficacemente contro un infezione.

PRIMA CLONAZIONE DI ANIMALE ESTINTO:

Leggendo il titolo di questo articolo ci affascina ritornare al 1993 quando veniva girato da Steven Spielberg il noto film Jurassic Park, in cui alcuni scienziati erano riusciti addirittura a riportare in vita dinosauri. In realtà quello che hanno fatto alcuni ricercatori del Consiglio Nazionale delle Ricerche Istituto per l'Agricoltura e l'Alimentazione di Madrid insieme a Jose Folch, scienziato del centro di Tecnologia Alimentare e la ricerca di Aragona, a Saragozza, è di clonare una specie di ovino estinta ; si tratta del Bucardo, un tipo di capra selvatica tipica dei Pirenei che dal 2000 è dichiarata estinta quando l’ultimo esemplare, una femmina di 13 anni chiamata Celia, fu trovata morta nel Nord della Spagna. Grazie a campioni di pelle prelevati proprio da Celia e conservati in Azoto liquido, è stato possibile clonare il primo animale estinto e riportarlo in vita.

LO STRANO CASO DELLE CELLULE STAMINALI

La notizia che segue è ormai vecchia di un mese e mezzo, infatti è stata pubblicata su Nature il 1 luglio, (qui potete trovare la traduzione completa dell'articolo di nature gli Italiani fanno causa per le cellule staminali ). Noi di biosproject anche se con ritardo abbiamo deciso di pubblicarla ugualmente. La notizia parla di tre ricercatrici italiane, tre scienziate, che hanno citato in giudizio il governo italiano per la decisione di escludere le cellule staminali embrionali da un recente bando per il finanziamento della ricerca sulle staminali. Nella bozza originale il bando non esclude le staminali embrionali, né la legge italiana impedisce del tutto la ricerca. E a questo si appellano Elisabetta Cerbai, farmacologa dell’Università di Firenze, Elena Cattaneo, dell’Università di Milano, e Silvia Garagna, dell’Università di Pavia.

MALARIA: novità per il vaccino.

La malaria è una malattia causata da un parassita chiamato Plasmodium, un protozoo, che viene trasmesso attraverso i morsi di zanzare infette. Al giorno d'oggi rappresenta la malattia più diffusa causata da parassiti. Nel corpo umano, questi parassiti si moltiplicano nel fegato, infettando i globuli rossi.
I sintomi includono febbre, mal di testa e vomito, e di solito compaiono tra i 10 ei 15 giorni dopo il morso di una zanzara infetta. Se non trattata, la malaria può degenerare diventanto estremamente pericolosa per la vita causando l'interruzione dell'afflusso di sangue agli organi vitali. In molte parti del mondo, questi parassiti hanno sviluppato resistenza ad una serie di farmaci che vengono utilizzati contro la malaria.

LA TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE.

Lo sviluppo della tecnologia del DNA ricombinante si basa sulla modificazione del DNA in provetta utilizzando gli stessi enzimi che ritroviamo all'interno delle cellule. L'avvento di tale tecnologia fu stimolato dai risultati della ricerca biochimica, che all'inizio degli anni 70 ha fornito ai biologi molecolari gli enzimi per la manipolazione del DNA in provetta. Questi enzimi sono di solito presenti all'interno delle cellule, ad esempio le DNA polimerasi coinvolte nei processi replicativi del DNA.

OSELTAMIVIR: MECCANISMO D'AZIONE

In attesa del vaccino per l'influenza A/H1N1, molte nazioni hanno richiesto scorte di antivirali, in particolare di Oseltamivir (nome commerciale Tamiflu) e di Zanamivir. Ma qual è il meccanismo d'azione di questi antivirali?

TAMIFLU: CORSA ALLE SCORTE

Si parla sempre più spesso della nuova influenza A/H1N1 e la paura della sua diffusione ha contagiato un pò tutti. Infatti da recenti indagini è risultato che in questo periodo vi è stato un vero e proprio boom di vendita senza ricetta di Tamiflu, l'antivirale contro la pandemia più diffuso, nelle farmacie del nostro Paese. L'associazione Altroconsumo nell'inchiesta svolta tra il 28 e 29 luglio 2009 ha constatato e denunciato al Ministero della Salute e delle Politiche Sociali e alla Federazione Nazionale dell'Ordine dei Farmacisti che su un totale di 20 farmacie scelte casualmente tra Roma e Milano:

• solo 4 farmacie non hanno venduto il Tamiflu per assenza di prescrizione medica
  
• 14 vendono l'antivirale anche in assenza di prescrizione medica
  
• in 2 il farmaco era stato esaurito.

Forse molti non sanno che gli antivali, tra cui l'oseltamivir (Tamiflu, Roche) in Italia vanno venduti solo dopo presentazione di ricetta al farmacista e quindi dopo un'attenta valutazione clinica da parte del medico. Quali sono i rischi/risultati di questa corsa alle scorte? Innanzitutto è bene ricordare ciò che ha precisato il Ministero della Salute nella Circolare del 22 luglio 2009, inviata alle autorita' sanitarie regionali, cioè che c'è "necessita' di razionalizzare le risorse disponibili di antivirali" soprattutto limitando "un uso improprio, che potrebbe portare a consumo di scorte disponibili, oltre che a induzione di resistenza ai ceppi virali". Inoltre in questo modo nessuna informazione riguardante le modalità di assunzione del farmaco viene data alla popolazione. Infine è bene guardarsi anche da chi specula sul fenomeno. Sono vari i siti nel web che offrono il Tamiflu a prezzi anche del 500% superiori al normale.

RU486 un farmaco? o un veleno letale?

Così spiega monsignor Giulio Sgreccia l'immissione in commercio del farmaco Mifepristone, più comunemente chiamato RU486, la cosidetta "pillola abortiva". La chiesa infatti ritiene l'utilizzo di tale un delitto da scomunica. Il farmaco è gia utilizzato in altri paesi europei, e adesso arriva anche in Italia dopo delibera del consiglio di amministrazione dell'AIFA (Agenzia del farmaco). La pillola potrà essere utilizzata solo in ospedale entro il 49/o giorno di gravidanza, oltre questi limiti infatti le complicanze aumentano rispetto all'aborto chirurgico. L'aborto chimico infatto presenta le sue complicanze che possono talvolta portare alla morte del paziente come dimostrano i 29 casi di decesso. Si tratta di un ormone steroideo con azione anti progestinica; il progesterone è l'ormone che assicura il mantenimento della gravidanza, viene prodotto inizialmente dal corpo luteo il quale poi viene mantenuto intatto grazie all'intervento dell'HCG (Gonadotropina corionica umana) prodotta intorno al sesto giorno dopo la fecondazione e cioè all'incirca nella fase di annidamento nell'utero. L'HCG permane fino a che la produzione di progesterone non è sostituita da produzione placentare. L'RU486 legandosi al recettore nucleare del progesterone, entra in competizione con l'ormone provocando l'inibizione dell'azione dello stesso sui geni delle cellule uterine, bloccando lo sviluppo embrionale e causando il distacco e l'eliminazione della mucosa uterina in un processo simile a quello mestruale. Tale farmaco quindi impedendo l'annidamento è clinicamente utilizzato al fine di interruzioni di gravidanza terapautiche spesso accompagnato da un intervento secondario con introduzione di fattori luteinici come una Prostaglandina, che provoca la contrazione uterina, favorendo l'eliminazione della mucosa e dell'embrione.

TRIPANOSOMI AFRICANI: MAGHI DEL TRAVESTIMENTO

Molti avranno di sicuro sentito parlare almeno una volta della malattia del sonno (tripanosomiasi africana). Questa malattia è causata da un parassita, il protozoo flagellato Trypanosoma brucei, è un parassita del sangue veicolato dalla mosca tse-tse (specie di mosche appartenenti al genere della glossina). Una volta entrato nell'ospite l'infezione dovuta a questo parassita dura molto a lungo terminando con la morte dell'ospite. In realtà il protozoo viene ricosciuto dal sistema immunitario e ad ogni attacco la stragrande maggioranza di questi parassiti viene distrutta, ma una piccola parte riesce sempre a sopravvivere e a ripopolare il sangue mantenendo attiva l'infezione. Ciò avviene perchè questo microrganismo ha una grande capacità nel modificare rapidamente la proteina di rivestimento. Infatti ogni triposoma è rivestito da 10 milioni di molecole di una singola glicoproteina. Il sistema immunitario riconosce questa proteina di rivestimento, ma prima che tutti i triposomi siano uccisi alcuni riescono a cambiare la glicoproteina di superficie in un altra che non è immediatamente riconosciuta dal sistema immunitario, di conseguenza i parassiti proliferano nuovamente nel sangue. Questa storia si ripete varie volte e grazie a questa capacità il parassita riuscirà sempre a sopravvivere mantenendo l'infezione per settimane o anche mesi fino a quando l'ospite muore. La capacità del parassita di modificare le glicoproteine di superficie è dovuto alla presenza nel loro genoma di geni che codificano diverse varianti di queste glicoproteine, in ogni istante solo uno di questi geni è attivo mentre gli altri sono silenti. Questo fa si che durante la malattia, i geni che vengono espressi cambiano continuamente, facendo in modo che il parassita modifichi spesso le sue proteine di rivestimento, riuscendo così ad eludere il sistema immunitario.

PERCHE' NEL DNA RITROVIAMO LA TIMINA E NON URACILE?

Perchè a differenza dell'RNA nel DNA troviamo la timina (immagine sopra) al posto dell'uracile? In fondo entrambe si appaiano all'adenina. La risposta sta nel fatto che la timina contribuisce a garantire la fedeltà della replicazione. Nel DNA durante i processi della replicazione vengono commessi degli errori nella sintesi delle nuove catene polinucleotidiche complementari agli stampi; errori che vengono corretti dalle DNA polimerasi o da altri enzimi coinvolti nella riparazione degli errori. Una delle mutazioni più comuni è la deamminazione della citosina che porta a formare l'uracile. In ogni istante un piccolo numero di residui di citosine perde il suo gruppo amminico mediante deamminazione venendo così convertito in uracile.

Per fare un esempio: che cosa succederebbe se durante la replicazione una base di C-G si separasse? Se l'uracile fosse una base del DNA, in quel punto la citosina che è stata deamminata ad uracile si appaierebbe con una adenina piuttosto che con una guanina. Di conseguenza se l'uracile fosse una base comunemente presente nel DNA, le DNA polimerasi appaierebbero un'adenina in corrispondenza di un uracile, e non ci sarebbe modo di capire che la presenza dell'uracile è dovuta ad una mutazione, di conseguenza l'errore non sarebbe corretto. Poichè l'uracile non è una base naturale del DNA, le DNA polimerasi possono riconoscerla come un errore e sostituirla. Ecco perchè la timina, nonostante abbia come unica differenza strutturale dall'uracile la presenza di un gruppo metile al C-5, contribuisce ad assicurare che la replicazione del DNA avvenga in maniera efficiente.