CROMATOGRAFIA PER ESCLUSIONE MOLECOLARE O GEL FILTRAZIONE.

Le nostre conoscenze sulla struttura delle proteine e sulla loro funzionalità derivano da studi che hanno permesso di analizzare in dettaglio le strutture e le caratteristiche delle proteine.

Separazione e purificazione delle proteine.
Primo passo fondamentale nello studio delle proteine è quello di determinarne in dettaglio le proprietà, composizione in amminoacidi, sequenza amminoacidica ecc. Per fare ciò è necessario separare le proteine di nostro interesse da tutte le altre. Una cellula contiene migliaia di proteine differenti, come si riesce a purificarne solo una?

RT PCR: REVERSE TRANSCRIPTASE POLYMERASE CHAIN REACTION

E' una metodica di analisi dei trascritti mediante l'abbinamento dell'azione della trascrittasi inversa con amplificazione tramite pcr. La sigla reverse transcriptase sta per trascrittasi inversa. Si prepara del cDNA (ovvero una molecola di DNA sintetizzato sullo stampo di una molecola di mRNA) sintetizzato da molecole di RNA estratto da cellule da studiare e si amplifica selettivamente quello che interessa. L'mRNA viene incubato con un oligonucleotide formato solo da timine oligo d+t, il quale si appaierà con la sequenza di poliA presente all'estremità 3' dell'mRNA. L'oligo dt funge da innesco per la sintesi di un filamento di DNA ad opera della trascrittasi inversa. SI ottiene, quindi un duplex ibrido di mRNA-cDNA.

L'mRNA può essere eliminato per trattamento con alcali o con la ribonucleasi. rimuovendo l'RNA rimane il cDNA neosintetizzato o singolo filamento usando un secondo oligonucleotide specifico come innesco ed il primo filamento di cDNA come stampo. La molecola di cDNA così ottenuta può essere amplfificata mediante PCR usando gli stessi 2 oligonucleotidi come innsesco (oligo dt e primer specifico). In questa maniera si dovrebbe avere una amplificazione assolutamente specifica e quindi in definitiva una maggiore sensibilità.

cDNA: dna complementare

Il cDNA (DNA complementare) sono copie in DNA degli mRNA cellulari ottenuti con l'enzima trascritasi inversa, la quale è una DNA polimerasi-RNA stampo dipendente. L'ottenimento del cDNA rappresenta un metodo valido per poter analizzare e islare specifici geni eucariotici. La maggior parte degli mRNA eucariotici può essere ottenuta mediante cromatorafia su oligo d/t cellulosa (cromatografia per affinità per intenderci). Per ottenere copie di DNA la prima cosa che si fà è di ottenere dei primer con queste olio d/t che si associano alle code di poli adenina (poliA) presenti all'estremità 3' degli mRNA eucariotici. In seguito si aggiunge la trascrittasi inversa e tutti i tipi di nucleotidi (dTTP, dATP, dGTP, dCTP) in modo da consentire alla trascrittasi inversa di sintetizzare il cDNA. In questo modo si ottiene una doppia elica ibrida di cDNA-mRNA, in seguito si aggiunge la DNA polimerasi I di E.Coli; RNAsi H e nucleotidi trifosfati come dTTP, dATP, dCTP, dGTP.

La RNasi H degrada l'RNA, in realtà non totalmente infatti lascierà alcuni frammenti associati allo stampo, e qui entra in gioco la DNA pol I che oltre all'attività polmerasica possiede l'attività esonucleasica 5'-3' tramite la quale rimuoverà i frammenti di RNA legati sostituendoli con i dNTP e portando alla formazione di una doppia elica di cDNA. CI sta da aggiungere che la polimerasi lascierà come suo solito dei nick sul filamento neosintetizzato a causa del suo associarsi e dissociarsi continuamente dal filamento stampo, i nick saranno chiusi da una DNA ligasi. In ultimo alle estremità piatte del cDNA saranno aggiunte dei linker contenenti siti di riconoscimento per enzimi di restrizione portando così ad estremità coesive. In questo modo una volta che un cDNA derivante da un gene è stato identificato,  potrà essere utilizzato anche per il clonaggio. Infatti come descriveremo in futuro i cDNA possono essere utilizzati anche per la costruzione di librerie genomiche

PCR: POLYMERASE CHAIN REACTION

Abbiamo detto nei scorsi post che con l'avvento della tecnologia del DNA ricombinante, i ricercatori sono riusciti, utilizzando gli enzimi che ritroviamo comunemente nelle cellule a studiare il DNA, in seguito con il clonaggio, evoluzione della tecnologia del DNA ricombinante si è riusciti ad amplificare un unico e specifico frammento di DNA e ad ottenerne innumerevoli copie sfruttando i vettori plasmidici e fagici, ma il clonaggio del DNA però è particolarmente laborioso e lungo.

COSMIDI: vettori per frammenti più grandi di DNA.

I cosmidi sono particolari vettori che potremmo definire come un ibrido costituito da fagi λ e plasmidi, in parole povere è un vettore per la clonazione di frammenti di DNA che possiede le caratteristiche dell'uno e dell'altro. Il cosmide è in grado di replicarsi nella cellula come un plasmide ed essere imballato come un fago. Tuttavia, il cosmide può trasportare inserti di DNA che sono circa tre volte più grandi di quelle realizzate dalla particella fagica λ (più grande di circa 45 kb). La chiave nel funzionamento dei cosmidi è che la maggior parte della struttura del fago λ come abbiamo accennato nel post precedente è stato soppresso, ma le sequenze segnale che promuovono l'inserimento del DNA nel capside (siti cos) rimangono. Questa struttura permette di modificare le teste dei fagi la quali possono essere farcite con quasi tutto il DNA del donatore. In questo modo possono essere confezionati nei capsidi usando il sistema di impacchettamento in vitro.

pUC8 E I VETTORI FAGICI.

RIFORMA GELMINI: i ricercatori protestano per i tagli ai finanziamenti.

Sarà che per mia natura tendo ad essere delle volte un pò pessimista, però secondo me, ed è solo un mio parere, la storia del governo del fare non sta proprio in piedi, la storia del premiare i più meritevoli per mascherare in realtà tagli scellerati agli atenei e alla ricerca mi sa solo di spot pubblicitario, la storia dell'adesso arrivano i castigamatti che mettono apposto l'italia degli sprechi mi sa di ennesima presa in giro all'italiana. Per carità, che l'università italiana avesse dei seri problemi nessuno lo mette in dubbio, che il sistema universitario italiano fosse un "pò" in degrado, perverso, penso che ormai lo sappiano tutti, però, anche se siamo un paese con le pezze al sedere, non è così che si migliorano le cose.