mercoledì 7 aprile 2010

PCR: POLYMERASE CHAIN REACTION



Abbiamo detto nei scorsi post che con l'avvento della tecnologia del DNA ricombinante, i ricercatori sono riusciti, utilizzando gli enzimi che ritroviamo comunemente nelle cellule a studiare il DNA, in seguito con il clonaggio, evoluzione della tecnologia del DNA ricombinante si è riusciti ad amplificare un unico e specifico frammento di DNA e ad ottenerne innumerevoli copie sfruttando i vettori plasmidici e fagici, ma il clonaggio del DNA però è particolarmente laborioso e lungo.
La PCR invece è una tecnica estremamente più efficiente e meno costosa del clonaggio, grazie ad essa possiamo replicare ripetutmente e selettivamente una sequenza di DNA. Solo per fare un esempio, se volessimo costruire una biblioteca genomica dovremmo utilizzare una grande quantità di DNA e di conseguenza utilizzare un gran numero di cellule o tessuti da cui prelevare il DNA o l'mRNA. Al contrario la singola copia di genoma presente in uno spermatozoo, o la piccola quantità di DNA, può grazie a questa tecnica essere essere replicato in migliaia di copie in un solo pomeriggio.

LA PCR AMPLIFICA ESPONENZIALMENTE UN DNA TARGET
La PCR funziona secondo un semplice meccanismo che permette di replicare esponenzialmente frammenti di DNA di nostro interesse. Tale processo utilizza l'ibridazione del DNA e i meccanismi della replicazione. Una volta che una specifica regione del DNA di nostro interese è stata scelta per essere studiata (lunga pochi nucletotidi fino a centinaia di coppie di basi) l'amplifichiamo tramite PCR. Per farlo si sfrutta la conoscenza che si ha sulla sequenza (conoscenza che avremo acquisito mediante metodiche come il sequenziamento del DNA) per sintetizzare due oligonucleotidi che corrispondono alle estremità della regione target: un oligonucleotide complementere ad una estremità della molecola di DNA; l'altro oligonucleotide complementare all'altro filamento all'altra estremità. Il processo di amplificazione inizia con l'ibridazione di tali oligonucleotidi con i due filamenti di DNA. Gli oligonucleotidi agiscono da primer permettendo alla DNA polimerasi di creare nuovi filamentidi complementari a quelli stampo, nella regione compresa tra i due primer. E' intuitivo imaginare come questi frammenti nucleotidici che vengonon sintetizzati diventano essi stessi gli stampi per la sintesi di nuovi frammenti di DNA e da ciò deriva il termine reazione a catena della polimerasi. Questa replicazione sarà seguita da un successivo ciclo di replicazione in cui i filamenti iniziali, sia quelli sintetizzati nella fase precendente diventano stampo per altri filamenti. Vediamo un pò più da vicino il processo:

A differenza del clonaggio la PCR è una rezaione in provetta e non comporta l'utilizzo di cellule viventi: la copia viene sintetizzata non da enzimi cellulari ma da una DNA polimerasi termostabile purificata da T. acquaticus.

1) Si mescolano DNA bersaglio, taq polimerasi, una coppia di primer oligonucleotidici, necessari per iniziare la replicazione del DNA e una quantità sufficiente di nucleotidi che serviranno per la costruzione di nuovi filamenti. La quantità di frammenti di DNA possono essere anche esigue, dal momento che la PCR è estremamente sensibile e funziona pure con piccolissime quantità di DNA.

2) La reazione è iniziata scaldando la miscela a temperature elevate, circa 94 C°, temperatura alla quale i legami idrogeno che tengononuniti i due polinucleotidi della doppia elica si rompono. IN questo modo il DNA viene denaturato molecole a singolo filamento. la temperatura in seguito viene ridotta a 50-60 C° ciò causa un parziale riappaiamento dei filamenti denaturati permettendo anche ai primer di potersi legare alle molecole stampo sulle regioni complementari, a questo punto può iniziare la sintesi del DNA e la temperatura viene portata a circa 74 C° valore ottimale per la taq polimerasi. In questo processo vengono sintetizzati una serie di frammenti di DNA detti anche "frammenti lunghi".  Questi filamenti hanno estremità 5'identiche ma estremità 3' diverse a seconda di dove terminerà la replicazione casualmente. Quando il ciclo di denaturazione-appaiamento-sintesi viene ripetuto, questi prodotti  lunghi agiranno da stampo per la sintesi di altre molecole di DNA dando origine a dei prodotti corti le cui estremità 5' e 3' sono stabilite dalle posizioni in cui si sono legati i primer. Nei cicli successivi il numero di questi prodotti si accorcerà sempre di più fino a quando uno dei reagenti non si sarà completamente esaurito.
La metodica della PCR è molto efficace e consente di sintetizzare sequenze di DNA, la cui concentrazione raddoppia ad ogni ciclo, quindi è una metodica di tipo esponenziale. Dieci cicli produranno 1.026 copie di DNA originale.  La procedura è rapida, in quanto ogni ciclo occupa solo pochi minuti usando un ciclatore termico, macchina in grado di automatizzare i cicli fra i cambiamenti di temperatura in modo programmato.
Uno svantaggio della PCR è che la taq polimerasi no ha attività esonucleasica 3'-5' do proreading, per cui durante il processo di replicazione possono essere introdotti nella copia di DNA.
Naturalmente, se un errore viene introdotto in un ciclo precoce di PCR, allora tute le copie successive avranno l'errore. La PCR è anhe soggetta a contaminazioni, cioè se la stessa miscela di reazione viene contaminata con DNA a cui si possono legare i primers allora anche qiel dDNA ouò essere replicato insieme al DNA curato. Ecco perchè i laboratori che effettuano la PCR devono curare in manienra minuziosa l'ambiente, il quale deve essere sterilizzato e preparato adeguatamente per ogni fase di un ciclo di PCR, in modo tale che o sperimentatore sarà in grado di ottenere la massima resa di reazione, milioni di copie di DNA target di interesse con il minimo errore. L'introduzione nella metodica della PCR dell'enzima Taq polimerasi termostabile ha trasformato la PCR in una reazione completamente automatizzata nei cicli termici in cui tutti i componenti della reazione vengono  mescolati in un unica provetta all'inizio della reazione in una sola volta o nelle quantità sufficienti a realizzare almeno 30-35 cicli

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