LA TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE.

Lo sviluppo della tecnologia del DNA ricombinante si basa sulla modificazione del DNA in provetta utilizzando gli stessi enzimi che ritroviamo all'interno delle cellule. L'avvento di tale tecnologia fu stimolato dai risultati della ricerca biochimica, che all'inizio degli anni 70 ha fornito ai biologi molecolari gli enzimi per la manipolazione del DNA in provetta. Questi enzimi sono di solito presenti all'interno delle cellule, ad esempio le DNA polimerasi coinvolte nei processi replicativi del DNA.
I biologi molecolari per determinare le funzionalità di questi enzimi ne hanno studiato le reazioni in provetta utilizzandoli in seguito per modificare in maniera mirata le molecole di DNA allo scopo di studiarle. In seguito la tecnica del DNA ricombinante ha portato allo sviluppo del clonaggio del DNA o di geni dove brevi frammenti contenenti un singolo gene vengono inseriti in un plasmide o in un cromosoma virale e fatti amplificare; ma parleremo di questo nei prossimi post.

Le DNA polimerasi utilizzate nella ricerca: Molte delle DNA polimerasi che sono utilizzate nella ricerca sono versioni modificate della DNA polimerasi I dell'E.coli. Questo enzima è conosciuto anche con il nome di polimerasi di Kornberg dal nome del suo scopritore. La DNA polimerasi I è uno dei principali enzimi coinvolti nella replicazione del DNA dell' E.coli ed ha entrambe le attività esonucleasiche 5'-3' e 3'-5'. Il fatto che possieda entrambe le attività esonucleasiche è un problema perchè limita la capacità di utilizzo di questo enzima nella modificazione del DNA. Il problema principale lo da l'attività 5'-3'. In questo caso l'enzima è in grado di rimuovere i nucleotidi alle estremità 5' che sono stati appena sintetizzati, è improbabile che tutto il nucleotide venga completamanete degradato in quanto l'attività polimerasica prevale su quella esonucleasica, ma vi sono particolari tecniche che diventano inutili anche se il filamento di DNA viene accorciato di un solo nucleotide. Un esempio è il sequenziamento del DNA tecnica nella quale se manca anche solo un nucleotide all'estremità 5' risulta poi impossibile determinare correttamente la sequenza del DNA. Ecco perchè all'inizio degli anni 70 si iniziò ad utilizzare una versione modificata della DNA pol I conosciuta con il nome di polimerasi di Klenow. In poche parole la DNA pol I veniva opportunamente modificata ottenendo così una versione della DNA pol I senza l'attività esonucleasica 5'-3'. In realtà oggi questo enzima viene utilizzato poco trovando più che altro impiego nella marcatura del DNA. La DNA polimerasi I mostra una funzionalità ottimale fino alla temperatura di 37° C, temperatura che si trova normalmente nell'ambiente in cui vive l'E.coli come l'intestino dell'uomo ad esempio. A temperature superiori (75 °C ed oltre) la DNA pol I viene denaturata perdendo la sua funzionalità. Un esempio di altre DNA polimerasi che vengono utilizzate in biologia molecolare è la Taq polimerasi che trova largo impego nella PCR. Questo enzima è ottenuto dal batterio Thermus acquaticus che vive nelle sorgenti di acqua calda dove le temperature arrivano anche a 95°C. Altro tipo di DNA polimerasi importante in biologia molecolare è la trascrittasi inversa, si tratta di una DNA polimerasi RNA-dipendente che genera copie di DNA da uno stampo di RNA. In genere questi enzimi sono coinvolti nei processi replicativi dei virus ad RNA, i cosidetti retrovirus. La trascrittasi inversa come vedremo in seguito può essere utilizzata per copiare molecole di DNA in molecole di mRNA. Copie che vengono definite DNA complementare (cDNA).

DNA LIGASI: i frammenti di DNA che sono stati digeriti con le endonucleasi di restrizione possono essere ricongiunti o saldati ad una nuova molecola grazie alle DNA ligasi. La reazione richiede però un dispendio energetico che viene fornita aggiungendo ATP o NAD alla miscela di reazione, a seconda del tipo di DNA ligasi che andiamo a scegliere. La più utilizzata deriva dal fago T4. Questo enzima è coinvolto nella replicazione del DNA del fago ed è codificato dal genoma di T4. Il suo ruolo naturale è quello di sintetizzare legami fosfodiesterici tra i nucleotidi separati presenti in un polinucleotide a doppio filamento. Per saldare due frammenti la ligasi deve essere in grado di sintetizzare due legami fosfodiesterici, uno per ogni filamento, e la reazione può avvenire solo se le due estremità che devono essere unite si vengono a trovare casualmente vicine, dal momento che la ligasi non è in grado da sola di legare le due estremità e portarle vicino. Se nella miscela le due estremità grazie a movimenti casuali vengono in contatto si formano dei legami transienti tra le estremità sporgenti e complementari. Questo legame non è molto stabile ma resiste abbastanza per consentire alla DNA ligasi di compiere il suo dovere e legare le estremità separate.



Infatti se le molecole hanno estremità piatte non possono appaiarsi neanche temporaneamente e il legame ad opera della ligasi non può avvenire, anche se la concentrazione di DNA nella soluzione è particolarmente elevata. Ecco perchè si è pensato convertire estremità piatte in coesive, in modo tale da facilitare il meccanismo di ligazione. In uno di questi metodi si attaccano delle molecole note come DNA linker, sono dei veri e propri adattatori alle estremità piatte. Questi piccoli frammenti contengono una sequenza di riconoscimento per una endonucleasi di restrizione e quindi producono una estremità coesiva dopo il trattamento con l'enzima appropriato; nell' esempio (scusate ma non riesco proprio a trovare immagini) il dna linker contiene una sequenza di ricooscimento per l'enzima BamHI.

3'__________________5' 5'____GGATCC____3' (LINKER)
5'__________________3' 3'____CCTAGG____5'

In questo caso il DNA linker contiene una sequenza di riconoscimento per l'enzima di restrizione BamHI i linker vengono attaccati alle estremità piatte della molecola di DNA...

3'________________________GGATCC___5'
5'________________________CCTAGG___3'

...La sequenza di riconoscimento viene tagliata dall'enzima di restrizione creando così una estremità coesiva.

3'________________________G 5'
5'________________________CCTAGG 3'


Enzimi di modificazione terminale: Un esempio di enzima di modificazione terminale è la deossinucleotidil transferasi terminale. E' una DNA polimerasi stampo indipendente che è capace di sintetizzare polinucleotidi senza la presenza di un filamento stampo complementare di DNA o RNA. in questo caso si crea una estremità coesiva grazie ad una coda omopolimerica i cui nucleotidi sono aggiunti in successione ad una estremità piatta ad esempio al 3'. Se la miscela di reazione contiene il DNA che deve essere modificato, l'enzima di modificazione terminale, e uno dei 4 nucleotidi, il nuovo filamento che viene aggiunto sarà costituito da quell'unico nucleotide. Nell'esempio (e neanche qui ho trovato un immagine!!!) aggiungiamo una coda di citosina. In seguito questa coda di poli C permetterà alla molecola di legarsi ad una seconda molecola di DNA che abbiamo reso coesiva con una coda di poli G (in modo che sia complementare alla coda di poli C) creata allo stesso modo.

________GGGGGGGGGG 3' (CODA DI POLI G)

____ 5'

altri enzimi usati di frequente sono la fosfatasi alcalina e la polinucleotide chinasi T4 che agiscono insieme. La loro applicazione principale è nella marcatura terminale del DNA.