cDNA: dna complementare

Il cDNA (DNA complementare) sono copie in DNA degli mRNA cellulari ottenuti con l'enzima trascritasi inversa, la quale è una DNA polimerasi-RNA stampo dipendente. L'ottenimento del cDNA rappresenta un metodo valido per poter analizzare e islare specifici geni eucariotici. La maggior parte degli mRNA eucariotici può essere ottenuta mediante cromatorafia su oligo d/t cellulosa (cromatografia per affinità per intenderci). Per ottenere copie di DNA la prima cosa che si fà è di ottenere dei primer con queste olio d/t che si associano alle code di poli adenina (poliA) presenti all'estremità 3' degli mRNA eucariotici. In seguito si aggiunge la trascrittasi inversa e tutti i tipi di nucleotidi (dTTP, dATP, dGTP, dCTP) in modo da consentire alla trascrittasi inversa di sintetizzare il cDNA. In questo modo si ottiene una doppia elica ibrida di cDNA-mRNA, in seguito si aggiunge la DNA polimerasi I di E.Coli; RNAsi H e nucleotidi trifosfati come dTTP, dATP, dCTP, dGTP.

La RNasi H degrada l'RNA, in realtà non totalmente infatti lascierà alcuni frammenti associati allo stampo, e qui entra in gioco la DNA pol I che oltre all'attività polmerasica possiede l'attività esonucleasica 5'-3' tramite la quale rimuoverà i frammenti di RNA legati sostituendoli con i dNTP e portando alla formazione di una doppia elica di cDNA. CI sta da aggiungere che la polimerasi lascierà come suo solito dei nick sul filamento neosintetizzato a causa del suo associarsi e dissociarsi continuamente dal filamento stampo, i nick saranno chiusi da una DNA ligasi. In ultimo alle estremità piatte del cDNA saranno aggiunte dei linker contenenti siti di riconoscimento per enzimi di restrizione portando così ad estremità coesive. In questo modo una volta che un cDNA derivante da un gene è stato identificato,  potrà essere utilizzato anche per il clonaggio. Infatti come descriveremo in futuro i cDNA possono essere utilizzati anche per la costruzione di librerie genomiche