Le nostre conoscenze sulla struttura delle proteine e sulla loro funzionalità derivano da studi che hanno permesso di analizzare in dettaglio le strutture e le caratteristiche delle proteine.
Separazione e purificazione delle proteine.
Primo passo fondamentale nello studio delle proteine è quello di determinarne in dettaglio le proprietà, composizione in amminoacidi, sequenza amminoacidica ecc. Per fare ciò è necessario separare le proteine di nostro interesse da tutte le altre. Una cellula contiene migliaia di proteine differenti, come si riesce a purificarne solo una?
I metodi più utilizzati sfruttano proprio le caratteristiche delle proteine, quelle proprietà che possono differenziare una proteina dall'altra, tra cui la grandezza, la carica, e le proprietà di legame. La fonte è in genere un tessuto o una cellula. La prima tappa nell'estrazione delle cellule è la rottura delle cellule, tale processo consente il rilascio delle proteine in una soluzione che viene comunemente chiamata estratto grezzo. Se è necessario, si può usare la centrifugazione differenziale per preparare le frazioni suvcellulari e isolare gli specifici organelli. Una volta ottenuto l'estratto grezzo si possono utilizzare le varie metodiche a disposizione per la separazione di una o più proteine contenute in tale estratto.
La soluzione viene in genere sottoposta a trattamenti in grado di separare le proteine in frazioni diverse i base a proprietà comuni delle proteine, carica, dimensione, viene effettuato un vero e proprio processo di frazionamento. Le prime tappe tendono ad utilizzare le differenze di solubilità delle varie proteine contenute nell'estratto, processo nel quale intervengono pH, temperatura, concentazione salina e altri fattori diversi. L'aggiunta di una corretta concentrazione di sali può determinare una precipitazione selettiva di alcune proteine, mentre altre restano in soluzione. L'ammonio solfato, è particolarmente efficace e viene spesso usato per far precipitare le proteine. Ovviamente bisogna fare in modo che la soluzione contenente la proteina di nostro interesse sia puificata il più possibile. Ad esempio attraverso un vero e proprio processo di dialisi si può separare la proteina da altri soluti sfruttando la maggiore dimensione della proteina. L'estratto parzialmente purificato viene trasferito in un sacchetto costituito da una membrana semipermeabile. Quando viene posto a contatto con un grande volume di una soluzione tampone con la giusta forza ionica, la membrana consente lo scambio di sali e tampone ma non delle proteine. Quindi la dialisi mantiene le proteine di grandi dimensioni all'interno del sacchetto o del tubo ma consente agli altri soluti di modificare la loro concentrazione fino a che non arrivano ad equilibrarsi con la soluzione che si trova all'esterno del sacchetto. La dialisi può essere usata per esempio per rimuovere l'ammonio solfato da una soluzione proteica. Eseguito il processo di purificazione; un
Separazione e purificazione delle proteine.
Primo passo fondamentale nello studio delle proteine è quello di determinarne in dettaglio le proprietà, composizione in amminoacidi, sequenza amminoacidica ecc. Per fare ciò è necessario separare le proteine di nostro interesse da tutte le altre. Una cellula contiene migliaia di proteine differenti, come si riesce a purificarne solo una?
I metodi più utilizzati sfruttano proprio le caratteristiche delle proteine, quelle proprietà che possono differenziare una proteina dall'altra, tra cui la grandezza, la carica, e le proprietà di legame. La fonte è in genere un tessuto o una cellula. La prima tappa nell'estrazione delle cellule è la rottura delle cellule, tale processo consente il rilascio delle proteine in una soluzione che viene comunemente chiamata estratto grezzo. Se è necessario, si può usare la centrifugazione differenziale per preparare le frazioni suvcellulari e isolare gli specifici organelli. Una volta ottenuto l'estratto grezzo si possono utilizzare le varie metodiche a disposizione per la separazione di una o più proteine contenute in tale estratto.
La soluzione viene in genere sottoposta a trattamenti in grado di separare le proteine in frazioni diverse i base a proprietà comuni delle proteine, carica, dimensione, viene effettuato un vero e proprio processo di frazionamento. Le prime tappe tendono ad utilizzare le differenze di solubilità delle varie proteine contenute nell'estratto, processo nel quale intervengono pH, temperatura, concentazione salina e altri fattori diversi. L'aggiunta di una corretta concentrazione di sali può determinare una precipitazione selettiva di alcune proteine, mentre altre restano in soluzione. L'ammonio solfato, è particolarmente efficace e viene spesso usato per far precipitare le proteine. Ovviamente bisogna fare in modo che la soluzione contenente la proteina di nostro interesse sia puificata il più possibile. Ad esempio attraverso un vero e proprio processo di dialisi si può separare la proteina da altri soluti sfruttando la maggiore dimensione della proteina. L'estratto parzialmente purificato viene trasferito in un sacchetto costituito da una membrana semipermeabile. Quando viene posto a contatto con un grande volume di una soluzione tampone con la giusta forza ionica, la membrana consente lo scambio di sali e tampone ma non delle proteine. Quindi la dialisi mantiene le proteine di grandi dimensioni all'interno del sacchetto o del tubo ma consente agli altri soluti di modificare la loro concentrazione fino a che non arrivano ad equilibrarsi con la soluzione che si trova all'esterno del sacchetto. La dialisi può essere usata per esempio per rimuovere l'ammonio solfato da una soluzione proteica. Eseguito il processo di purificazione; un
metodo di separazione delle proteine è la tecnica cromatografica.
Quelle più utilizzate in biologia molecolare e biochimica sono tre:
1)Gel filtrazione detta anche cromatografia per esclusione molecolare, che come dice il nome permette una discriminazione delle proteine in base al peso molecolare.
2)Cromatografia a scambio ionico che ci permette di discriminare le proteine in base alla carica elettrica.
3)Cromatografia per affinità che ci permette di discriminare le proteine in base alle sue caratteristiche biologiche, sfruttando in particolar modo l'affinità delle proteine verso particolari substrati chimici.
La cromatografia per esclusione molecolare fa uso di particolari resine come l'acrilamide o il sephadex detto comunemente destrano, la funzionalità di queste resine, prodotte sottoforma di microsfere, consiste nel fatto che le catene di questi polimeri connesse tra loro tramite ramificazioni e legami crociati, formano una particolare rete tridimensionale. Questo tipo di cromatografia è definita gel filtrazione o ad esclusione molecolare perchè le resine impregnandosi di acqua, diventano dei veri e propri gel comportandosi come un filtro o un setaccio e consentendo alle molecole più piccole di penetrare nelle maglie della rete, mentre la penetrazione è impossibile per le molecole dimensionalmente superiori alle maglie del gel.
La gel filtrazione si esegue riempiendo una colonna in cui si fa passare la soluzione di proteine da frazionare. Ad ogni contatto con le sfere di gel le molecole proteiche sono selezionate, quelle che sono troppo grandi rispetto alle maglie, non potendo penetrare nel gel, migrano più velocemente e vengono eluite per prime ad un volume detto V0 (volume di esclusione), mentre quelle che possono permeare le maglie tridimensionali della rete, vi penetrano.
La velocità di pentrazione sarà più o meno ritardata secondo la dimensione della molecola. Infatti quelle più piccole permeranno il gel più velocemente e verranno eluite ad un volume Vi detto volume di inclusione.
Quindi l'intervallo utile di frazionamento di una colonna di gel filtrazione è dato dalla differenza tra Vi- V0. Determinando il volume di eluizione della proteina della quale si vuole determinare il peso molecolare, andiamo a determinare il volume di eluizione da una colonna cromatografica precedentemente preparata con una proteina a peso molecolare noto e determinare il peso molecolare della proteina di interesse. Generalmente non si usano denaturanti in questo processo perchè le proteine denaturate avendo perso la struttura globulare, non sempre rispettano la relazione lineare. Questa metodica è usata anche per verificare se la proteina è un monomero o un oligomero, cioè se ha struttura quaternaria.
Nell'immagine sotto alcuni composti di uso più comune usati nella gel filtrazione.
La gel filtrazione si esegue riempiendo una colonna in cui si fa passare la soluzione di proteine da frazionare. Ad ogni contatto con le sfere di gel le molecole proteiche sono selezionate, quelle che sono troppo grandi rispetto alle maglie, non potendo penetrare nel gel, migrano più velocemente e vengono eluite per prime ad un volume detto V0 (volume di esclusione), mentre quelle che possono permeare le maglie tridimensionali della rete, vi penetrano.
La velocità di pentrazione sarà più o meno ritardata secondo la dimensione della molecola. Infatti quelle più piccole permeranno il gel più velocemente e verranno eluite ad un volume Vi detto volume di inclusione.
Quindi l'intervallo utile di frazionamento di una colonna di gel filtrazione è dato dalla differenza tra Vi- V0. Determinando il volume di eluizione della proteina della quale si vuole determinare il peso molecolare, andiamo a determinare il volume di eluizione da una colonna cromatografica precedentemente preparata con una proteina a peso molecolare noto e determinare il peso molecolare della proteina di interesse. Generalmente non si usano denaturanti in questo processo perchè le proteine denaturate avendo perso la struttura globulare, non sempre rispettano la relazione lineare. Questa metodica è usata anche per verificare se la proteina è un monomero o un oligomero, cioè se ha struttura quaternaria.
Nell'immagine sotto alcuni composti di uso più comune usati nella gel filtrazione.
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