CROMATOGRAFIA PER ESCLUSIONE MOLECOLARE O GEL FILTRAZIONE.

Le nostre conoscenze sulla struttura delle proteine e sulla loro funzionalità derivano da studi che hanno permesso di analizzare in dettaglio le strutture e le caratteristiche delle proteine.

Separazione e purificazione delle proteine.
Primo passo fondamentale nello studio delle proteine è quello di determinarne in dettaglio le proprietà, composizione in amminoacidi, sequenza amminoacidica ecc. Per fare ciò è necessario separare le proteine di nostro interesse da tutte le altre. Una cellula contiene migliaia di proteine differenti, come si riesce a purificarne solo una?

RT PCR: REVERSE TRANSCRIPTASE POLYMERASE CHAIN REACTION

E' una metodica di analisi dei trascritti mediante l'abbinamento dell'azione della trascrittasi inversa con amplificazione tramite pcr. La sigla reverse transcriptase sta per trascrittasi inversa. Si prepara del cDNA (ovvero una molecola di DNA sintetizzato sullo stampo di una molecola di mRNA) sintetizzato da molecole di RNA estratto da cellule da studiare e si amplifica selettivamente quello che interessa. L'mRNA viene incubato con un oligonucleotide formato solo da timine oligo d+t, il quale si appaierà con la sequenza di poliA presente all'estremità 3' dell'mRNA. L'oligo dt funge da innesco per la sintesi di un filamento di DNA ad opera della trascrittasi inversa. SI ottiene, quindi un duplex ibrido di mRNA-cDNA.

L'mRNA può essere eliminato per trattamento con alcali o con la ribonucleasi. rimuovendo l'RNA rimane il cDNA neosintetizzato o singolo filamento usando un secondo oligonucleotide specifico come innesco ed il primo filamento di cDNA come stampo. La molecola di cDNA così ottenuta può essere amplfificata mediante PCR usando gli stessi 2 oligonucleotidi come innsesco (oligo dt e primer specifico). In questa maniera si dovrebbe avere una amplificazione assolutamente specifica e quindi in definitiva una maggiore sensibilità.

cDNA: dna complementare

Il cDNA (DNA complementare) sono copie in DNA degli mRNA cellulari ottenuti con l'enzima trascritasi inversa, la quale è una DNA polimerasi-RNA stampo dipendente. L'ottenimento del cDNA rappresenta un metodo valido per poter analizzare e islare specifici geni eucariotici. La maggior parte degli mRNA eucariotici può essere ottenuta mediante cromatorafia su oligo d/t cellulosa (cromatografia per affinità per intenderci). Per ottenere copie di DNA la prima cosa che si fà è di ottenere dei primer con queste olio d/t che si associano alle code di poli adenina (poliA) presenti all'estremità 3' degli mRNA eucariotici. In seguito si aggiunge la trascrittasi inversa e tutti i tipi di nucleotidi (dTTP, dATP, dGTP, dCTP) in modo da consentire alla trascrittasi inversa di sintetizzare il cDNA. In questo modo si ottiene una doppia elica ibrida di cDNA-mRNA, in seguito si aggiunge la DNA polimerasi I di E.Coli; RNAsi H e nucleotidi trifosfati come dTTP, dATP, dCTP, dGTP.

La RNasi H degrada l'RNA, in realtà non totalmente infatti lascierà alcuni frammenti associati allo stampo, e qui entra in gioco la DNA pol I che oltre all'attività polmerasica possiede l'attività esonucleasica 5'-3' tramite la quale rimuoverà i frammenti di RNA legati sostituendoli con i dNTP e portando alla formazione di una doppia elica di cDNA. CI sta da aggiungere che la polimerasi lascierà come suo solito dei nick sul filamento neosintetizzato a causa del suo associarsi e dissociarsi continuamente dal filamento stampo, i nick saranno chiusi da una DNA ligasi. In ultimo alle estremità piatte del cDNA saranno aggiunte dei linker contenenti siti di riconoscimento per enzimi di restrizione portando così ad estremità coesive. In questo modo una volta che un cDNA derivante da un gene è stato identificato,  potrà essere utilizzato anche per il clonaggio. Infatti come descriveremo in futuro i cDNA possono essere utilizzati anche per la costruzione di librerie genomiche

PCR: POLYMERASE CHAIN REACTION

Abbiamo detto nei scorsi post che con l'avvento della tecnologia del DNA ricombinante, i ricercatori sono riusciti, utilizzando gli enzimi che ritroviamo comunemente nelle cellule a studiare il DNA, in seguito con il clonaggio, evoluzione della tecnologia del DNA ricombinante si è riusciti ad amplificare un unico e specifico frammento di DNA e ad ottenerne innumerevoli copie sfruttando i vettori plasmidici e fagici, ma il clonaggio del DNA però è particolarmente laborioso e lungo.

COSMIDI: vettori per frammenti più grandi di DNA.

I cosmidi sono particolari vettori che potremmo definire come un ibrido costituito da fagi λ e plasmidi, in parole povere è un vettore per la clonazione di frammenti di DNA che possiede le caratteristiche dell'uno e dell'altro. Il cosmide è in grado di replicarsi nella cellula come un plasmide ed essere imballato come un fago. Tuttavia, il cosmide può trasportare inserti di DNA che sono circa tre volte più grandi di quelle realizzate dalla particella fagica λ (più grande di circa 45 kb). La chiave nel funzionamento dei cosmidi è che la maggior parte della struttura del fago λ come abbiamo accennato nel post precedente è stato soppresso, ma le sequenze segnale che promuovono l'inserimento del DNA nel capside (siti cos) rimangono. Questa struttura permette di modificare le teste dei fagi la quali possono essere farcite con quasi tutto il DNA del donatore. In questo modo possono essere confezionati nei capsidi usando il sistema di impacchettamento in vitro.

pUC8 E I VETTORI FAGICI.

RIFORMA GELMINI: i ricercatori protestano per i tagli ai finanziamenti.

Sarà che per mia natura tendo ad essere delle volte un pò pessimista, però secondo me, ed è solo un mio parere, la storia del governo del fare non sta proprio in piedi, la storia del premiare i più meritevoli per mascherare in realtà tagli scellerati agli atenei e alla ricerca mi sa solo di spot pubblicitario, la storia dell'adesso arrivano i castigamatti che mettono apposto l'italia degli sprechi mi sa di ennesima presa in giro all'italiana. Per carità, che l'università italiana avesse dei seri problemi nessuno lo mette in dubbio, che il sistema universitario italiano fosse un "pò" in degrado, perverso, penso che ormai lo sappiano tutti, però, anche se siamo un paese con le pezze al sedere, non è così che si migliorano le cose.

NELLA BANANA UN INIBITORE DELL'HIV.

ANN ARBOR, Michigan - Un nuovo potente inibitore dell'HIV, derivato dalla banana, può aprire le porte a nuovi trattamenti per prevenire la trasmissione sessuale del virus, secondo uno studio dell' Università del Michigan Medical School  pubblicato questa settimana.

Cellule Dottor jekyll e Mr. Hyde all'origine della distrofia.

Un team di ricercatori dell'Università della British Columbia hanno identificato delle cellule che producono il grasso che possiedono una "doppia personalità" e possono ulteriormente preludere alllo sviluppo di terapie per le malattie muscolari come la distrofia muscolare e la fibrosi.

Per la precisione, l'équipe ha scoperto un nuovo tipo di progenitori fibro/adipogenici, o FAP, che generano grassi tessuti fibrosi una volta trapiantate nei muscoli danneggiati nei topi. Tali cellule sono simili alle staminali nella loro capacità di differenziarsi, ma sono limitati nel numero di volte in cui si possono dividere.

La scoperta è stata pubblicata su numero di Nature Cell Biology

"La funzionalità di queste cellule sono in genere in sospeso nei tessuti muscolari", spiega l'autore Fabio Rossi, del Canada Research Chair in medicina rigenerativa. "Una volta attivata da un danno, che producono segnali che coordinano la rigenerazione dei tessuti e poi scompaiono. Questo è la parte del Dr. Jekyll di FAP."

"Nelle malattie croniche muscolari come la distrofia muscolare, tuttavia, le FAP persistono e possono contribuire ad un eccesso di produzione di tessuto cicatriziale, causando fibrosi. Questa è la parte di Mr Hyde", dice Rossi, professore associato presso il Dipartimento di Genetica Medica e il Biomedical Research Centre.

Una migliore comprensione del ruolo delle FAP potrebbe contribuire a favorire la loro sana attività o reprimere i loro effetti negativi, dicono i ricercatori. A lungo termine, farmaci che hanno come obiettivo queste cellule possono essere utili in una vasta gamma di malattie caratterizzate da fibrosi che vanno da quelle cardiovascolari a quelle polmonari, fino alle malattie renali e al trapianto d'organi. Inoltre, la capacità delle cellule di generare nuovo tessuto adiposo potrebbe essere sfruttato per curare le patologie metaboliche.

IL CROMOSOMA Y: la sua evoluzione è più veloce del previsto.

Tempo fa era stato lanciato l'allarme, uno studio pubblicato su Plos genetics aveva dichiarato che il cromosoma Y stava lentamente scomparendo. Ebbene un nuovo studio sembra smentire quanto detto precedentemente, annunciando addirittura che il cromosoma Y si stia evolvendo rapidamente.

CGH convenzionale

Le tecniche citogenetiche sono molto importanti nell’individuazione di aberrazioni cromosomiche in soggetti con tumori o disordini dello sviluppo. Fino ad ora, con le tecniche citogenetiche tradizionali (bandeggi) si è riusciti ad ottenere un massimo di risoluzione di 5Mb (megabasi). Successivamente, con la FISH è stato possibile individuare squilibri genomici nell’intervallo di 5 – 5000 Kb. Con questa tecnica è però possibile analizzare solo loci specifici, e non l’intero genoma di un individuo.

L’avvento della CGH (comparative genomic hybridization), una tecnica citogenetica molecolare, ha permesso per la prima volta di effettuare contemporaneamente l’analisi dell’intero genoma, cioè di tutti i cromosomi, rivelando la presenza di duplicazioni o delezioni in qualsiasi locus. Tale tecnica si basa sul principio della competizione tra due DNA genomici marcati con fluorocromi differenti (un DNA di riferimento, cioè il Control DNA e un DNA da cellule tumorali del paziente, cioè il Test DNA) per il legame a cromosomi metafasici di un soggetto sano, quindi normali, nel caso della CGH convenzionale, o a sequenze omologhe di DNA immobilizzate su un array nel caso della CGH-Array.

NUOVE SCOPERTE SUL DNA

Il DNA, depositario molecolare dell'informazione genetica è costituito da un insieme di molecole note come nucleotidi, sono 4 e sono chiamati Adenina, Guanina, Citosina, Timina. Ormai sappiamo da decenni che negli organismi superiori, ma questo è vero anche per organismi come i procarioti, che alcune Citosine presenti nella molecola di DNA sono leggermente diverse da altre citosine. Diversità che risiede in una modifica strutturale che tali basi nucleotidiche subiscono nota con il nome di metilazione. Tale modifica strutturale non altera nessuna delle proprietà d'appaiamento delle citosine metilate per cui quest'ultime si appaieranno sempre con le Guanine sul filamento complementare, e non altera neanche altri processi come la replicazione del DNA. Nel metilare alcune citosine e altre no le cellule svolgono un vero e proprio ruolo di etichettatura molecolare che ha un preciso significato epigenetico attraverso cui i geni possono essere regolati, o come accade nell'E.coli proteggere il genoma dalle endonucleasi di restrizione che lo stesso batterio produce.

Viene reso noto su un articolo pubblicato da Nature che è stato effettuato un esperimento che aveva lo scopo di individuare tutte le citosine che sono metilate in una specifica linea cellulare differenziata per paragonarle con le cellule staminali totipotenti. Ciò che si sapeva da tempo è che tutte le citosine metilate erano seguite da una guanina, per la precisione le citosne metilate comparivano in regioni del DNA che presentavano regioni con sequenze ripetute di CG. Ma ecco che vi è stata una sorpresa, è stato scoperto che in una parte delle cellule staminali la metilazione delle citosine è presente anche in sequenze di CC, CT, CA. Questa notizia è completamente nuova e sembra far parte del carattere essenziale delle cellule staminali totipotenti.

Sintomi di Aterosclerosi in mummie di oltre 3500 anni fa

Anche gli antichi egizi soffrivano di cuore. Indizi di calcificazione vascolare e aterosclerosi, due delle maggiori cause di malattie cardiache, sono state riscontrate in mummie di oltre 3500 anni fa da un'equipe di medici del Mid America Hearth Institute (Kansas City, USA). Non si può più parlare, quindi, di malattie esclusive dell'uomo moderno: le patologie cardiovascolari potrebbero invece essere ancora più antiche delle piramidi. I risultati di questo studio sono stati presentati al Meeting annuale dell'America Heart Association e pubblicati sul Journal of the America Medical Association.

La ricerca, guidata dal professor Randall C. Thompson in collaborazione con egittologi, esperti di conservazione di reperti antichi e analisti di immgini, è stata condotta su 22 mummie datate dal 1981 a.C. al 364 d.C. e custodite al museo di antichità egiziane del Cairo. Dei corpi studiati, 14 appartenevano a persone di alto lignaggio, tra cui quello di Rai, la dama di compagnia della regina Nefertari. Tutte le mummie, sono state sottoposte a Tomografia computerizzata a Raggi X, per avere una visione tridimensionale di alcune sezioni di tessuto. Dalle indagini, è risultato che l'aterosclerosi era presente in nove dei corpi studiati, ed era più frequente in quelle persone morte oltre i 45 anni di età; è stato riscontrato anche un caso di base cardiaca calcificata, un sintomo di solito associato all'infarto. La mummia più antica nella quale sono stati riscontrati sintomi simili, risale al 1530-1570 a.C.

"Non possiamo dire se l’aterosclerosi sia stata la causa della morte di queste persone", spiega Samuel Wann, uno degli autori della ricerca. Certo è che lo studio mette in discussione alcune presunte certezze contemporanee. "Abbiamo sempre pensato - continua Wann - che l'aterosclerosi fosse una malattia da 'McDonald’s', provocata da uno stile di vita tipico dei nostri giorni, e che le persone vissute tre o quattromila anni fa fossero meno a rischio nonostante una dieta ricca di proteine e sale: non fumavano, facevano esercizio fisico e non mangiavano cibi grassi". Questi ultimi studi sembrano invece raccontare una storia diversa.