LA LEGGE DI HARDY-WEINBERG CORRELA LE FREQUENZE ALLELICHE E GENOTIPICHE

Ci sono diverse malattie ereditarie causate da alleli difettivi, recessivi rispetto a quelli selvatici. Una domanda fondamentale è quanto sono comuni questi alleli recessivi in una popolazione? E quanto comuni sono i portatori eterozigoti?
La legge di Hardy-Weinberg cerca di rispondere a questi quesiti. Questa legge cerca di offrire una legge generale che possa permettere di descrivere l'eredità degli alleli in una popolazione.
Tale legge prevede però che debbano essere effettuate delle considerazioni sulla natura della popolazione, sugli individui all'interno di essa e sui geni che questi individui all'interno di essa e sui geni che questi individi portano. La Legge di Hardy-Weinberg si può applicare se si verificano cinque condizioni principali: 1) La popolazione comprende un numero di individui molto ampio, quasi infinito. 2) Gli individui incrociano a caso, nel senso che il genotipo di ogni individuo per il locus di interesse non influenza la scelta del compagno/a con cui incrociarsi. 3)Non devono sorgere nuove mutazioni nel pool genico 4)Non si verifica alcun tipo di migrazione 5)Nessun genotpo influenza il fenotipo e la capacità di sopravvivenza dell'organismo fino all'età riproduttiva e di trasmettere quindi i propri geni alla generazione successiva. Le popolazioni che rispettano queste leggi sono in equilibrio con la legge di Hardy-Weinberg. Ovviamente nella realtà queste cose non accadono, nessuna popolazione rispetta tutte queste caratteristiche, le condizioni che una popolazione deve avere per essere in equilibrio con la legge di Hardy-weinberg permettono di elaborare un'equazione matematica per calcolare le frequenze genotipiche (e quindi fenotipiche), nella realtà però nessuna popolazione obbedisce a queste regole. Le popolazioni hanno sempre un numero limitato di organismi, anche la migrazione avviene spesso, le mutazioni sono sempre presenti, non possono non essere prese in considerazioni alterazioni genotipiche che sono alla base di malattie anche letali, e prattutto queste alterazioni influenzano notevolmente la sopravvivenza e la riproduzione di questi organismi. La legge di H-W può comunque essere sfruttata per ottenere delle stime sulle frequenze genotipiche e fenotipiche.
Esempio: prendiamo in considerazione una popolazne di organismi diploidi, gli individui che la compongono possono riprodursi sessualmente, devono essere eseguii due passaggi per convertire la frequenza genotipica di una popolazione, nella frequenza genotipica della generazione successiva.
Se la possibilità che un individuo riesca a diventare adulto, non dipenda dal genotipo, (quindi non vi sono differenze di fitness tra gli individui), allora le frequenze alleliche negli dulti sono le stesse anche nei gameti.
Assumiamo che negli adulti  frequenza dell'allele A sia dato dalla lettera p e quella dell'allele a è indicata con q, i valori p e q saranno anche le frequenze dei due alleli nei gameti prodotti dall'intera popolazione di quegli adulti.
Le frequenze alleliche dei gameti possono essere utilizzate le frequenze genotipiche degli zigoti nella generazione successiva.
Usiamo un quadrato di Punnet per rendere l'esempio, ci permette di poter prendere in considerazione tutte le possibili combinazioni di unione dei gameti.

Come possiamo osservare nell'immagine, se la fecondazione è casuale, con probabilità che unione della cellula uovo e spermatozoo non dipenda dal genotipo di queste due cellule, e la popolazione di gameti è molto elevata avremo ciò che osserviamo nel quadrato di punnet.

Gli zigoti AA sono il risultato della fecondazione di cellule uovo con allele A che sono fecondate da spermatozooi che portano l'allele A.
Abbiamo accennato poc'anzi che con la lettera p andiamo ad indicare la frequenza dei gameti A. Applicando la regola del prodotto avremo p X p = p^2
Discorso analogo lo facciamo per gli alleli recessivi a, gli zigoti aa saranno il risultato della fecondazione delle cellule uovo  che portano l'allele a da parte di spermatozooi che portano allele a. Quindi per la regola del prodotto avremo q X q= q^2.
Gli zigoti Aa sono il risultato della fecondazione di cellule uovo A da parte di spermatozooi a; la frequenza è data da p X q= pq; la frequenza totale è data da pq Xpq= 2pq.
Riassumendo: le frequenze dei genotipi, degli zigoti in una popolazione numerosa di organismi diploidi, a riproduzion sessuale, sono p^2 per AA; 2pq per Aa e q^2 per aa.
Queste frequenze genotipiche sono note come frequenze di Hardy-Weinberg, esse si verificano nelle popolazioni che soddisfano la legge di Hardy-Weinberg: un vasto numero di individui, incroci casuali, nesna mutazione, nessuna migrazione e nessuna differenza genotipica nella fitness.
Dal momento che queste frequenze genotipiche rappresentano la totalità dei genotipi nella popolazione, la loro somma deve essere uguale a 1.
Otteniamo in questo modo un equazione:
p^2 + 2pq +q^2 = 1.
Abbiamo assunto che non ci siano differenze nella fitness, le frequenze genotipiche degli zigi saranno le frequenze genotipiche della generazione adulta che si sviluppa da quegli zigoti.
Questa equazione ci permette di utilizzare le informazioni su un genotipo e sulle frequenze alleliche per prevedere le frequenze genotipiche nella generazione successiva.
Esempio:
Abbimo una popolzione di 100000 individui in cui è presente un allele recessivo a che causa una malattia genetica.
Nella popolazione abbiamo 100 individui omozigoti per l'allele recessivo (aa), 1800 eterozigoti (Aa).
Per conoscere i portatori eterozigoti nella generazione successiva, dobbiamo calcolare la frequenza allelica nella popolazione parentale.
98100 individui AA, 1800 individui Aa; 100 individui aa

su 200000 alleli totali circa abbiamo che p= 0,99, per l'allele a la frequenza è q=0,01. Sostituiamo questi valori nell'equazione di Hardy-Weinberg e calcoliamo la frequenza genotipica della generazione successiva.
Possiamo prevedere che nella generazione successiva di 100000 individui avremo :
1) 98010 individui AA
2)1980 individui Aa
3)10 individui a

Le frequenze genotipiche sono leggermente cambiate. Le frequenze alleliche?
Una frazione degli individui p^2 è AA, con due alleli A e una frazione 2pq degli individui Aa , 1/2 dei quali è A.  Ragionamento analogo, q^2 , una frazione è aa con due alleli a, una frazione è Aa, 1/2 dei quali è a.
Se p+q=1 allora q-1=p e la frequenza nell'allele A nella generazione successiva è:
p^2 + 1/2 [2p(1-p)] =p^2+p (1-p) =p^2+p-p^2=p.

In maniera simile p= 1-q e la frequenza dell'allele r nella generazione successiva è:
q^2 +1/2[2q(1-q)]= q^2+q (1-q)= q^2+q-q^2= q.
 Utilizzando queste formule per calcolare le frequenze alleliche di A e a nella seconda generazione di 100000 indiidui alcuni dei quali sono malati geneticamente si ottiene per p=0,99 frequenza per l'allele A e 0,01 per l'allele a, le stesse della generazione precedente. Quindi anche se sono cambiate le frequenze genotipiche quelle alleliche non lo sono ciò vale sia per il dominante che per il recessivo.
Qundi in una popolazione in euilibrio con la legge di Hardy-Weinberg le frequenze alleliche non cambiano di generazione in generazione fino a quando particolari eventi non influenzano il tutto, tramite introduzione o rimozione di alleli.

RELAZIONE TRA FREQUENZE GENOTIPICHE E FENOTIPICHE: La legge di Hardy-Weinberg parte1

La stima delle frequenze alleliche ha valore predittivo? Possiamo usarle per predire le frequenze genotipiche?

La legge di Hardy-Weinberg.

Prendiamo in considerazione una popolazione di 16 individui; sei appartenenti a questa popolazione sono affetti da una malattia causata da alleli recessivi, li indichiamo con la lettera (a), variante allelica del selvatico A.

Il nostro scopo è di prevedere come il numero di individui che affetti dalla malattia, nella popolazione evolveranno nel tempo. Per farlo determiniamo la frequenza di ciascun genotipo (omozigoti AA, eterozigoti Aa, omozigoti aa), di ciascun fenotipo (normale, malato) e di ciascun allele (A; a).

La frequenza fenotipica la possiamo descrivere come la proporzione di individui in una popolazione che presenta un particolare fenotipo .

Nel nostro caso la frequenza fenotipica è data da 6/16 cioè 3/8 di persone che presentano la malattia (quindi omozigoti aa), 10/16 cioè 5/8 per i normali (persone con genotipo AA e Aa).

La frequenza genotipica è la proporzione di individui in una popolazione che presentano un particolare genotipo. In questo caso per determinare la frequenza genotipica dobbiamo contare necessariamente il numero degli individui della popolazione. Per i caratteri recessivi, è semplice, ma per gli individui che sono sia omozigoti per l'allele selvatico ed eterozigoti, entrambi danno individui sani, per determinarne la frequenza si deve ricorrere ad analisi più raffinate, quali ad esempio l'utilizzo di sonde molecolari per individuare e distinguere alleli diversi.

Supponiamo di aver eseguito le nostre analisi e i risulati ci dimostrano che: (8/16 sono AA; 2/16 sono Aa, 6/16 sono aa). La frequenza genotipica è: 1/2 AA; 1/8 Aa; 3/8 aa.

Frequenza allelica.

E'la proporzione in una popolazione di tutte le copie di un gene che compaiono sotto forma di un particolare allele. Per frequenza allelica intendiamo la proporzione di un determinato allele rispetto al totale degli alleli  di quel gene presenti in una popolazione. Dal momento che ogni individuo possiede due copie di ciascun gene, il numero totale delle copie geniche è due volte il numero degli individui nella popolazione di nostro interesse. quindi nel nostro caso 32 copie del gene responsabile della malattia. Omozigoti ed eterozigoti contribuiscono alla frequenza di un allele. 

Ovviamente l'omozigote contribuisce due volte, gli eterozigoti una volta sola.

Per calcolare la frequenza di A e a dobbiamo utilizzare il numero di persone di ogni genotipo per valutare il numero di alleli A; a.

8 AA--->16 copie di A

2 Aa--->2 copie di A

6 aa--->0 copie di A

facendo la somma abbiamo 18 copie del gene A. Ripetendo il ragionamento per l'allele a abbiamo:

8 AA--->0 copie di a

2Aa---> 2 copie di a

6 aa---> 12 copie di a

la somma è di 4 copie del gene a. Per trovare il numero totale di copie del gene sommiamo 18 A e 14 a per n totale di 32 copie del gene che rappresenta il doppio del numero degli individui nella popolazione.

Per determinare la proporzione o la frequenza di ciascun allele dobbiamo dividere il numero di ogni allele per Il numero totale di copie del gene; per l'allele A 18/32= 9/16= 0,56

Il numero totale di copie del gene; per l'allele a 14/32= 7/16= 0,44

Un esempio per comprendere come i genetisti utilizzano queste frequenze come base per calcolare le variazioni genotipiche e fenotipiche di un gene in una popolazione e come può cambiare nel tempo.

PROSSIMAMENTE: GENETICA DI POPOLAZIONI.

A breve il post...

AUGURI DI BUONE FESTE!!!

MUTAZIONI E STRUTTURA GENETICA: l'esperimento di Benzer.

Seymour Benzer, genetista americano, dimostrò, tramite l'utilizzo di saggi di ricombinazione, che due mutazioni diverse, che non complementavano tra di loro e che erano quindi localizzate sullo stesso gene, alteravano regioni differenti di quel gene.

Partendo dall'ipotesi che se la ricombinazione può avvenire non solo tra due geni, ma anche all'interno di un singolo gene, un crossing over tra due cromosomi omologhi che presentano due diverse mutazioni nello stesso gene avrebbe potuto, qualora si verificassero le condizioni, ripristinare l'allele selvatico.

Esempio: abbiamo due cromosomi omologhi, su di essi ipotizziamo che siano presenti molti sti che possono mutare indipendentemente, laricombinazione tra due geni darà luogo alla formazione di un cromosoma recante un allele dove sono presenti entrambe le mutazioni e un cromosoma con allele selvatico.

Se sono presenti molte posizioni su cui possono verificarsi mutazioni ne consegue che si dovrà analizzare un grande numero di progenie  per poter osservare almeno un evento come quello descritto sopra.

Benzer come organismo sperimentale scelse il batteriofago T4 un virus a DNA che infetta i batteri Escherichia Coli. In genere da ogni infezione, la progenie risultante è di circa 100-1000 fagi prodotti. Un numero elevato, inoltre non si deve attendere tanto tempo per avere una progenie così numerosa da poter analizzare, in questo modo Benzer riuscì ad ottenere in breve tempo molti ricombinanti rari da poter analizzare.

Le mutazioni sul gene rII-.

I virus sono organismi molto piccoli, possono essere osservati solo con l'aiuto di un microscopio elettronico, ma vi sono delle caratteristiche riguardanti la loro attività che possono essere osservate ad occhio nudo. Per poter osservare questa caratteristica, i genetisti mescolano una popolazione di particelle fagiche con un grande numero di batteri ospiti e poi travasano la mistura in una capsula petri dove le cellule saranno immobilizzate su agar contenente nutrienti necessari alla loro crescita.

Quando un fago infetta una cellula batterica, la cellula viene costretta a produrre la progenie fagica che al termine del ciclo di replicazione sarà riversata nell'ambiente esterno, in seguito i fagi inizieranno ad infettare le altre cellule batteriche presenti nelle vicinanze.

I batteri muoiono per lisi al termine del ciclo di replicazione virale, dopo molti cicli di replicazione si osserva una area chiara circolare chiamata placca dove sono presenti le cellule batteriche morte. Il resto della superficie della piastra petri invece risulterà ricoperta da una patina opalescente cosituita da cellule vive. Le placche contengono un grande numero di particelle virali, anche svariati milioni, originate dal batteriofago che ha infettato originariamente una cellula batterica in quella posizione.

In seguito vengono effettuate diluizioni seriali della soluzione contenente i fagi permettendo di misurare il numero di fagi presenti in una placca e di trovare il numero di particelle virali.

Andando alla ricerca di particolari caratteristiche genetiche associate al batteriofago Benzer trovò di mutanti che quando venivano aggiunti ad una colonia di batteri E.coli definiti di ceppo B, davano origine a delle placche più ampie con dei contorni più netti e arrotondati di quelle prodotte con il batteriofago selvatico. Questo tipo di placche sembravano derivare da un rapido processo di lisi da parte dle batterio ospite, Benzer chiamò r la mutazione che dava origine a questo fenomeno.

Molte mutazioni a carico di r mappanoin una regione del cromosoma T4 noto come rII: tali mutazioni vengono definite rII-.

Altra caratteristica rende ideali queste mutazioni rII- per la mappatura delle mutazioni all'interno del gene.

I batteriofagi selvatici rII+ portano alla formazione di placche di forma e dimensioni normali sia in cellule di E.coli di ceppo B sia in un ceppo conosciuo come E.coli k. I mutanti rII- invece hanno una alterata specificità per l'ospite; non riescono a formare placche di lisi nei confronti dei batteri E.coli k.

Il perchè ciò si verificasse non era chiaro a Benzer, però riuscì a creare un test molto semplice ed efficace tramite il quale riuscì ad analizzare la funzione del gene rII+ e infine per comprendere la struttura del gene.

Per osservare se le mutazioni presenti sul gene rII ricombinavano tra di loro Benzer doveva essere certo che le mutazioni osservate fossero presenti sullo stesso gene.

Benzer per ottenere tale dimostrazione esegui dei test di complementazione assicurandosi che due cromosomi T4 entrassero nella stessa cellula.

Nel suo test  infettò cellule di E.coli k con due tipi di T4, uno contenente la mutazione rII- e uno contenente una mutazione rII- differente e poi osservava la lisi dei batteri. Per essere certo che tutte le cellule fossero infettate aggiunse un grande eccesso di fagi di etrambi i tipi rispetto alle cellule batteriche.

Le cellule di E.coli di ceppo k vengono infettate contemporaemanete con un ecceso di due diversi mutanti rII- (m1 e m2). All'interno della cellula le due mutazioni saranno in trans, in quato risiedono su coosomi diversi. Se le due mutazioni colpiscono lo stesso gene, alterano la stessa funzione e non potranno mplementare per ci non si originerà nessuna progenie fagica. Se le due mutazioni sono su geni diversi (rIIa e rIIB) allora avviene complementazione e causerannolisi batterica.

Se le due mutazioni rII- fossero state nello stesso gene, non si sarebbero formate placche, in quanto nessuno de due romosomi mutanti sarebbe stato in grado di fornire la funzione selvatica mancante.

Inoltre doveva essere sicuro che le mutazioni  rII- analizzate fossero entrambe recessive rispetto al selvatico e non interagissero tra di loro formando un rII- dominante.

Esperimento di controllo.

Per verificare questa possibilità esegui un esperimento di controllo,  in cui mise le due mutazioni rII- sullo stesso cromosoma e poi infettò le cellule E.coli k contemporaneamente e con questi doppi mutanti rII - e con fagi selvatici.

Il test di controllo per il test di complementazione è rappresentato dall'infezione simultanea di cellule E.coli di ceppo K con un ceppo T4 selvatico e ceppo contenente m1e m2. All'interno della cellula le due mutazioni sono in cis, cioè presenti sullo stesso cromosoma. Il rilascio di progenie faica dimostra che le mutazioni sono recessive e non ci sta interazione tra le due mutazioni con conseguente interferenza sulla lisi cellulare I test di complementazione sono significativi solo se entrambe recessive rispetto all'allele selvatico.

Se le mutazioni fossero state tutte recessive e non avessero interagito tra di loro i batteri sarebbero andati incontro a lisi e il test di complementazione sarebbe stato attendibile. Ma vi è differenza nel test di complementazione e in quello di controllo e tutta la differenza sta nella disposizone delle mutazioni rII-.

Nel test di complementazione una delle mutazioni rII- è su un cromosoma mentre l'altra è su un altro cromosoma, due mutazioni con questa disposizione si dice che si trovano in trans.

Mentrenel controllo le mutazioni sono sullo stesso cromosoma (quindi in cis). Il test di controllo e di complementazione è noto coe test cis-trans.

Benzer chiamò cistrone ogni gruppo di complementazione individuato mediante cis-trans.

Diversi test effettuati tenendo in consideraione diverse coppie di mutazioni rII- mostravano che queste muzioni ricadevano in due gruppi di complementazione noti come rIIA e rIIB. Tenendo conto di questo Benzer analizzò due mutazioni nello stesso gene e vide se ricombinando davano origine ad una progenie selvatica.

Un gene composto da subunità mutabili che possono ricombinare.
Quando Benzer infettò i batteri di E.coli B di ceppo B con una mistura di fagi contenente diverse mutazioni nello stesso gene (rIIA1 e rIIA2) osservò la comparsa di una progenie selvatica rII+ rivelata dalla capacità di crescere su cellule rII+ di E.coli k.

Le cellule B di E.coli sono infettate simultaneamente con un grande eccesso di due diversi mutanti rIIA 1 e2. Se non avviene ricombinazione nel tratto compreso tra le due mutazioni, ogni fago della progenie conterrà o una o l'altra delle due mutazioni originali e sarà fenotipicamente rII-.
Se invece avviene ricombinazione tra le due mutazioni, uno dei due prodotti sarà un ricombinante rII+, mentre il prodoto reciproco sarà un cromosoma doppio mutante che contiene sia rIIA 1 che 2.Quando la progenie fagica viene usata per infettare i batteri E.coli di ceppo k, solo i ricombinanti rII+ saranno in grado di formare le placche.

Come controllo, le cellule di E.coli B sono infettate con una gran quantità di n solo tipo di mutante (rIIA1 e 2). Gli unici fagi rII+ che si possono ottenere sono quelli originati dalla reversione di una o l'altra delle due mutazioni. Questo esperimento di controllo dimostra che i revertanti sono estremamente rari e che il loro apporto alla progenie rII+ ottenuta dall'esperimento sopra può essere trascurata.
Anche se le due mutazioni rIIA-, interessano due basi adiacenti il numero di ricombinanti rII+ ottenuto è 100 volte maggiore del numero di revertanti rII+ che possono essere prodotti nelle cellule infettate dai singoli mutanti.

Egli sapeva che questa progenie selvatica proveniva dalla ricombinazione e non da mutazioni inverse, poichè la frequenza delle particelle fagiche rII+ che osservava era molto più alta della frequenza di revertanti rII+ osservata nella progenie generata ingettando i batteri B singolarmente con i due mutanti.
Sulla base di queste osservazioni, Benzer trasse tre conclusioni riguardo alla struttura del gene:
a) un gene consiste di differenti parti ognuna delle quali può mutare.
b)la ricombinazione tra i diversi siti mutabili di uno stesso gene può generare un allele normale selvatico.
c) un gene svolge la sua normale funzione solo se tutte le sue componenti sono selvatiche.

TRASDUZIONE E MAPPATURA GENICA

La trasduzione è un processo di trasferimento genco che avviene tramite i batteriofagi. I batteriofagi detti comunemente fagi, sono virus che infettano e si moltiplicano all'interno di varie specie batteriche, portano avanti un ciclo litico, infatti la replicaizone di questi virus all'interno dei batteri che fungono da ospiti causa la morte per lisi dei batteri. Durante l'infezione si verifica però un trasferimento genico, una particella virale è in grado di incorporare un pezzo di cromosoma batterico e intridurre questo frammento di DNA batterico in altre cellule ospiti durante i successivi cicli d'infezione. Il processo attraverso il quale la particella virale trasferisce il DNA batterico da una cellla ospite ad un altra è conosciuto come trasduzione.

Mappatura dei geni mediante trasduzione.

Come nel caso della co-trasformazione, due geni strettamente associati sul cromosoma batterico possono essere co-trasdotti. La frequenza con cui due geni batterici sono costrasdotti dipende direttamente dalla distanza tra loro: più vicini sono più è probabile che venngano a trovarsi sullo stesso breve frammento di DNA e a impacchettarsi neello stesso fago trasducente. Due geni che distano più dellalunghezza del segmento di DNA che può essere impacchettato in una singola particella fagica non possono essere mai co-trasdotti.

Il batteriofgo P1 di E.coli ampiamente utilizzato in vari esperimenti genera particelle di trasduzione generalizzata ed è utile per la mappatura dei geni batterici. In uno studio di mappatura,  i batteri infettati dal fago P1 contenevano gli alleli selvatici di tre geni noti come: leu+, thr+, azi r; i tre geni stanno rispettivamente per leucina, treonina e resistanza alla sodioazide.

La progenie fagica ottenuta da questa infezione fu effettuata sfruttando particolari tecniche che consentivano la separazione dei fagi P1 trasducenti da quelli normali , sulla base della differente densità. Questi fagi furono usati per infettare batteri leu-, thr-, azi s. In seguito questi microrganismi furono piastrati in terreni selettivi per uno o due marcatori genetici ma non per tutti.

Per ciascuno dei tre esperimenti, in ogni esperimento veniva selezionato positivamente solo un marcatore, fu determinata la frequenza del marcatore non o dei marcatori non selezionati. Ad esempio le cellule leu+ del primo esperimento vennero ulteriormente analizzate per verificare se fossero thr+ o thr-, azi r oppure azi s.

I risultati indicarono che i i geni leu e azi erano trasdotti il 50% delle volte, mentre thr e leu lo erano solo nel 2% dei casi. Quindi gli ordini possibili dei geni erano due :

leu------azi-----------thr oppure era azi----leu------thr.

Un successivo esperimento indicò che leu e thr venivano cotrasdotti il 3% delle volte e thr e azi non venivano mai cotrasdotti, leu deve essere più vicino a thr che ad azi.

L'ordine dei geni quindi è:

azi----leu-------thr .

I dati ottenuti dal terzo esperimento erano in accordo con quest'utltima disposizione, in quanto il frammento che trasduceva thr e leu non conteneva mai il marcatore azi.

LA CONIUGAZIONE E LA MAPPATURA GENICA.

La coniugazione batterica è un processo di trasferimento genico unidirezionale che avviene tra un donatore di DNA e un ricevente, questo processo avviene grazie ad un plasmide definito coniugativo presente nel ceppo batterico donatore.

Il plasmide F e la coniugazione.

Le cellule che portano il plasmide F saranno chiamati semplicemente F+; le cellule senza plasmide saranno chiamate F-.

Il plasmide ha la peculiarità di portare molti geni che saranno utili per permettere il trasferimento del DNA, compresi i geni che codificano per proteine fondamentali per la creazione del cosidetto pilo, grazie al quale la cellula donatrice entra in contatto con la cellula ricevente, inoltre trasporta codifica per endonucleasi, enzimi in grado di poter scindere il DNA dei plasmidi F in siti specifici.

Quando il donatore entra in contatto con il ricevente, grazie al pilo, la ritrazione della stessa struttura avvicina le due cellule.

Il DNA del plasmide F viene tagliato, questo taglio determinerà l'inizio del trasferimento, un singolo filamento si sposterà lungo il ponte tra le due cellule. Il trasferimento del DNA F nel ricevente è, contemporaneamente, accompagnato dalla sintesi nel donatore di un altra copia del filamento di DNA che sta uscendo.

Quando il DNA del donatore entra nella cellula ricevente, riforma un circolo e il ricevente sintetizza il filamento di DNA complementare.

In seguito a questo incrocio il ricevente F- diventa F+ e il donatore rimane F+.

Il plasmide F tramite il processo della coniugazione, agisce come un virus nella popolazione umana, pochi batteri F+ (quindi batteri contenenti il plasmide) se vengono introdotti in una coltura di batteri F-, questi ultimi saranno resi F+ in poco tempo.

Il plasmide F e il batterio Escherichia Coli.

Il cromosoma del batterio E. Coli è disseminato di sequenze nucleotidiche note come sequenze IS (inserzione), il plasmide F a sua volta possiede tre sequenze IS identiche a quelle dell'E.coli, in alcuni casi avviene ricombinazione omologa (crossing over) tra l'elemento IS sul plasmide e sul cromosoma batterico , le cellule in cui i cromosomi portano un plasmide integrato sono note come cellule Hfr torneremo in seguito su queste cellule.

Incroci Hfr x F- e le mappe genetiche.

I geni in un cromosoma Hfr sono trasferiti al ricevente in un ordine riproducibile, i ricercatori compresero che potevano utilizzare gli incroci Hfr per mappare i geni. Per ottenere inormazioni utili i ricercatori analizzarono ceppi che differivano gli uni dagli altri negli alleli di diversi geni.

L'utilizzo di questi ceppi nella mappatura genetica trae vantaggio dal fatto che durante la coniugazione il DNA cromosomico si sposta dal donatore al ricevente ad una velocità costante.

L'esperimento di accoppiaento interrotto.

I ricercatori presero in considerazione i seguenti genotipi:

genotipo Hfr: STRs (sensibile alla streptomicina), THR+ (in grado di sintetizzare l'amminoacido treonina), AZIr (resistente alla sodio azide), TONr (resistente al fago T1), LAC+ (in grado di sintetizzare lattosio come unica fonte di glucosio), GAL+ (in grado di utilizzare il galattosio come unica fonte di carbonio).

Genotipo F-:  STRr (resistente alla streptomicina), THR- ( non sintetizza treonina), AZIs (sensibile alla sodio azide), TONs (sensibile al fago T1), LAC- ( non in grado di usare lattosio), GAL- (non in grado di usare galattosio).

In seguito utilizzarono un terreno di coltura non selettivo che permetteva la crescita di entrambi i ceppi, e stabilendo condizioni che permettevano la coniugazione, In seguito ad intervalli di un minuto si passò le aliquote di miscele d'incrocio furono agitate violentemente in un frullatore da cucina, ritenendo che l'agitazione violenta avrebbe separato coppie di cellule in coniugazione, prima che tutti i geni dal donatore fossero stati trasferiti al ricevente, interrompendo perciò l'incrocio.

In seguito piastrarono i campioni della coniugazione, prima che tutti i geni dal donatore fossero stati trasferiti al ricevente, interrompendo perciò l'incrocio.

SI piastrarono poi i campioni della coniugazione interrotta su capsule di Petri contenenti streptomicina, per uccidere le cellule donatrici originali.

Le piastre erano prive anche di treonina per selezionare a sfavore le cellule F- e THR-, chnon si erano incrociate. Infine, dopo la crescita degli ex coniuganti sulle piastre contenenti streptoicina senza treonina, usarono il replica plating per piastrare ogni colonia di ciascun ex coniugante su terreni selettivi per gli altri quattro marcatori presenti nei ceppi del donatore e del ricevente.

In questo modo riuscirono a determinare quali geni e in che ordine erano stati trasferiti nel ricevente F- prima che venisse interrotta la coniugazione.

Nell'imagine sotto sono mostrate le frequenze dei ceppi ricombinanti contenenti i vari alleli del ceppo donatore.

Le interruzioni sono avvenute prima dopo 8 minuti, una piccola frazione di ricombinanti era AZIr, ma nessuno portava altri alleli del donatore, a 10 minuti qualcuno dei ricombinanti presentava TONr del donatore. Dopo 15 minuti apparivano i primi alleli LAC+ nelle colonie ricombinanti e dopo 17 minuti si osservavano i ricombinanti presenti GAL+. La frequenza di coniuganti che contengono in particolare gene del donatore Hfr aumenta con il tempo, fino a raggiungere un plateu tipico per ciascun gene.

Le percentuali erano 90% AZIr, 80% TONr, 40% LAC+, 20% GAL+.

Quindi la presenza del plasmide F, integrato nel ceppo Hfr, spiega le due caratteristiche specifiche di ciascun gene, rivelate dagli esperimenti di coniugazione interrotta:  1) il tempo impiegato per il trasferimento dell'informazione genica dipende dal fatto che tutte le cellule donatrici portano il plasmide F nello stesso sito, sui loro cromosomi, e tutte iniziano il trasferimento del loro DNA nelle cellule F allo stesso momento e con lo stesso orienamento. In questo modo il tempo impiegato dal primo gene per entrare nella cellula ricevente riflette la distanza di quel gene dall'origine del trasferimento, localizzata nel plasmide F integrato. I primi, pochi donatori HfrH a stabilire una connessione per l'incrocio con un partner F- iniettano il loro allele AZIr da allora in poi-

I primi alleli TONr passano nelle cellule F- dopo circa 10 minuti mentre gli alleli LAC+ dopo circa 15 minuti, e i primi alleli GAL+ dopo circa 17 minuti.

Con l'interruzione della coniugazione, i ricercatori sono riusciti quindi a predire l'ordine dei geni sul cromosoma di E.coli e rende possibile mappare le distanze fra geni, le distanze vengono definite come minuti di trasferimento genico.