MUTAZIONI E STRUTTURA GENETICA: l'esperimento di Benzer.

Seymour Benzer, genetista americano, dimostrò, tramite l'utilizzo di saggi di ricombinazione, che due mutazioni diverse, che non complementavano tra di loro e che erano quindi localizzate sullo stesso gene, alteravano regioni differenti di quel gene.

Partendo dall'ipotesi che se la ricombinazione può avvenire non solo tra due geni, ma anche all'interno di un singolo gene, un crossing over tra due cromosomi omologhi che presentano due diverse mutazioni nello stesso gene avrebbe potuto, qualora si verificassero le condizioni, ripristinare l'allele selvatico.

Esempio: abbiamo due cromosomi omologhi, su di essi ipotizziamo che siano presenti molti sti che possono mutare indipendentemente, laricombinazione tra due geni darà luogo alla formazione di un cromosoma recante un allele dove sono presenti entrambe le mutazioni e un cromosoma con allele selvatico.

Se sono presenti molte posizioni su cui possono verificarsi mutazioni ne consegue che si dovrà analizzare un grande numero di progenie  per poter osservare almeno un evento come quello descritto sopra.

Benzer come organismo sperimentale scelse il batteriofago T4 un virus a DNA che infetta i batteri Escherichia Coli. In genere da ogni infezione, la progenie risultante è di circa 100-1000 fagi prodotti. Un numero elevato, inoltre non si deve attendere tanto tempo per avere una progenie così numerosa da poter analizzare, in questo modo Benzer riuscì ad ottenere in breve tempo molti ricombinanti rari da poter analizzare.

Le mutazioni sul gene rII-.

I virus sono organismi molto piccoli, possono essere osservati solo con l'aiuto di un microscopio elettronico, ma vi sono delle caratteristiche riguardanti la loro attività che possono essere osservate ad occhio nudo. Per poter osservare questa caratteristica, i genetisti mescolano una popolazione di particelle fagiche con un grande numero di batteri ospiti e poi travasano la mistura in una capsula petri dove le cellule saranno immobilizzate su agar contenente nutrienti necessari alla loro crescita.

Quando un fago infetta una cellula batterica, la cellula viene costretta a produrre la progenie fagica che al termine del ciclo di replicazione sarà riversata nell'ambiente esterno, in seguito i fagi inizieranno ad infettare le altre cellule batteriche presenti nelle vicinanze.

I batteri muoiono per lisi al termine del ciclo di replicazione virale, dopo molti cicli di replicazione si osserva una area chiara circolare chiamata placca dove sono presenti le cellule batteriche morte. Il resto della superficie della piastra petri invece risulterà ricoperta da una patina opalescente cosituita da cellule vive. Le placche contengono un grande numero di particelle virali, anche svariati milioni, originate dal batteriofago che ha infettato originariamente una cellula batterica in quella posizione.

In seguito vengono effettuate diluizioni seriali della soluzione contenente i fagi permettendo di misurare il numero di fagi presenti in una placca e di trovare il numero di particelle virali.

Andando alla ricerca di particolari caratteristiche genetiche associate al batteriofago Benzer trovò di mutanti che quando venivano aggiunti ad una colonia di batteri E.coli definiti di ceppo B, davano origine a delle placche più ampie con dei contorni più netti e arrotondati di quelle prodotte con il batteriofago selvatico. Questo tipo di placche sembravano derivare da un rapido processo di lisi da parte dle batterio ospite, Benzer chiamò r la mutazione che dava origine a questo fenomeno.

Molte mutazioni a carico di r mappanoin una regione del cromosoma T4 noto come rII: tali mutazioni vengono definite rII-.

Altra caratteristica rende ideali queste mutazioni rII- per la mappatura delle mutazioni all'interno del gene.

I batteriofagi selvatici rII+ portano alla formazione di placche di forma e dimensioni normali sia in cellule di E.coli di ceppo B sia in un ceppo conosciuo come E.coli k. I mutanti rII- invece hanno una alterata specificità per l'ospite; non riescono a formare placche di lisi nei confronti dei batteri E.coli k.

Il perchè ciò si verificasse non era chiaro a Benzer, però riuscì a creare un test molto semplice ed efficace tramite il quale riuscì ad analizzare la funzione del gene rII+ e infine per comprendere la struttura del gene.

Per osservare se le mutazioni presenti sul gene rII ricombinavano tra di loro Benzer doveva essere certo che le mutazioni osservate fossero presenti sullo stesso gene.

Benzer per ottenere tale dimostrazione esegui dei test di complementazione assicurandosi che due cromosomi T4 entrassero nella stessa cellula.

Nel suo test  infettò cellule di E.coli k con due tipi di T4, uno contenente la mutazione rII- e uno contenente una mutazione rII- differente e poi osservava la lisi dei batteri. Per essere certo che tutte le cellule fossero infettate aggiunse un grande eccesso di fagi di etrambi i tipi rispetto alle cellule batteriche.

Le cellule di E.coli di ceppo k vengono infettate contemporaemanete con un ecceso di due diversi mutanti rII- (m1 e m2). All'interno della cellula le due mutazioni saranno in trans, in quato risiedono su coosomi diversi. Se le due mutazioni colpiscono lo stesso gene, alterano la stessa funzione e non potranno mplementare per ci non si originerà nessuna progenie fagica. Se le due mutazioni sono su geni diversi (rIIa e rIIB) allora avviene complementazione e causerannolisi batterica.

Se le due mutazioni rII- fossero state nello stesso gene, non si sarebbero formate placche, in quanto nessuno de due romosomi mutanti sarebbe stato in grado di fornire la funzione selvatica mancante.

Inoltre doveva essere sicuro che le mutazioni  rII- analizzate fossero entrambe recessive rispetto al selvatico e non interagissero tra di loro formando un rII- dominante.

Esperimento di controllo.

Per verificare questa possibilità esegui un esperimento di controllo,  in cui mise le due mutazioni rII- sullo stesso cromosoma e poi infettò le cellule E.coli k contemporaneamente e con questi doppi mutanti rII - e con fagi selvatici.

Il test di controllo per il test di complementazione è rappresentato dall'infezione simultanea di cellule E.coli di ceppo K con un ceppo T4 selvatico e ceppo contenente m1e m2. All'interno della cellula le due mutazioni sono in cis, cioè presenti sullo stesso cromosoma. Il rilascio di progenie faica dimostra che le mutazioni sono recessive e non ci sta interazione tra le due mutazioni con conseguente interferenza sulla lisi cellulare I test di complementazione sono significativi solo se entrambe recessive rispetto all'allele selvatico.

Se le mutazioni fossero state tutte recessive e non avessero interagito tra di loro i batteri sarebbero andati incontro a lisi e il test di complementazione sarebbe stato attendibile. Ma vi è differenza nel test di complementazione e in quello di controllo e tutta la differenza sta nella disposizone delle mutazioni rII-.

Nel test di complementazione una delle mutazioni rII- è su un cromosoma mentre l'altra è su un altro cromosoma, due mutazioni con questa disposizione si dice che si trovano in trans.

Mentrenel controllo le mutazioni sono sullo stesso cromosoma (quindi in cis). Il test di controllo e di complementazione è noto coe test cis-trans.

Benzer chiamò cistrone ogni gruppo di complementazione individuato mediante cis-trans.

Diversi test effettuati tenendo in consideraione diverse coppie di mutazioni rII- mostravano che queste muzioni ricadevano in due gruppi di complementazione noti come rIIA e rIIB. Tenendo conto di questo Benzer analizzò due mutazioni nello stesso gene e vide se ricombinando davano origine ad una progenie selvatica.

Un gene composto da subunità mutabili che possono ricombinare.
Quando Benzer infettò i batteri di E.coli B di ceppo B con una mistura di fagi contenente diverse mutazioni nello stesso gene (rIIA1 e rIIA2) osservò la comparsa di una progenie selvatica rII+ rivelata dalla capacità di crescere su cellule rII+ di E.coli k.

Le cellule B di E.coli sono infettate simultaneamente con un grande eccesso di due diversi mutanti rIIA 1 e2. Se non avviene ricombinazione nel tratto compreso tra le due mutazioni, ogni fago della progenie conterrà o una o l'altra delle due mutazioni originali e sarà fenotipicamente rII-.
Se invece avviene ricombinazione tra le due mutazioni, uno dei due prodotti sarà un ricombinante rII+, mentre il prodoto reciproco sarà un cromosoma doppio mutante che contiene sia rIIA 1 che 2.Quando la progenie fagica viene usata per infettare i batteri E.coli di ceppo k, solo i ricombinanti rII+ saranno in grado di formare le placche.

Come controllo, le cellule di E.coli B sono infettate con una gran quantità di n solo tipo di mutante (rIIA1 e 2). Gli unici fagi rII+ che si possono ottenere sono quelli originati dalla reversione di una o l'altra delle due mutazioni. Questo esperimento di controllo dimostra che i revertanti sono estremamente rari e che il loro apporto alla progenie rII+ ottenuta dall'esperimento sopra può essere trascurata.
Anche se le due mutazioni rIIA-, interessano due basi adiacenti il numero di ricombinanti rII+ ottenuto è 100 volte maggiore del numero di revertanti rII+ che possono essere prodotti nelle cellule infettate dai singoli mutanti.

Egli sapeva che questa progenie selvatica proveniva dalla ricombinazione e non da mutazioni inverse, poichè la frequenza delle particelle fagiche rII+ che osservava era molto più alta della frequenza di revertanti rII+ osservata nella progenie generata ingettando i batteri B singolarmente con i due mutanti.
Sulla base di queste osservazioni, Benzer trasse tre conclusioni riguardo alla struttura del gene:
a) un gene consiste di differenti parti ognuna delle quali può mutare.
b)la ricombinazione tra i diversi siti mutabili di uno stesso gene può generare un allele normale selvatico.
c) un gene svolge la sua normale funzione solo se tutte le sue componenti sono selvatiche.