ESTRAZIONE DNA PLASMIDICO

I plasmidi sono piccole molecole di DNA extracromosomiale che nella tecnologia del DNA ricombinante possono essere utilizzate per introdurre frammenti di DNA di nostro interesse. Per preparare i plasmidi dobbiamo utilizzare necessariamente cellule che lo contengono, in questo caso i plasmidi li possiamo ricavare dai batteri. Sostanzialmente il dna plasmidico può essere estratto attraverso tre modalità: miniprep, midiprep, maxiprep; l'unica cosa che li differenza è la quantità di DNA plasmidico estratto, ma la modalità di estrazione è la stessa. Riassumiamo una miniprep, il protocollo completo è riportato nel post sopra (le immagini sono un pò piccole ma basta cliccarci sopra per ingrandirle). I batteri vengono fatti crescere in un terreno di coltura, e poi li raccogliamo tramite centrifugazione, il precipitato ottenuto viene poi sospeso in una soluzione di GTE (glucosio tris, EDTA) contenente l'enzima lisozima che causa la rottura della membrana batterica. Per la precisione questo enzima rompe i legami glicosidici tra il NAM (ac. N-acetilmuramico) e il NAG (N-acetilglucosammina) molecole che svolgono un ruolo di fondamentale importanza nella formazione del peptidoglicano, questo rende la cellula particolarmente suscettibile alla lisi, venendo a mancare una delle difese più importanti che il batterio ha a disposizione. Per provocare la lisi completa della cellula, la denaturazione delle proteine, l'idrolisi dell'RNA, si aggiungono alla sospensione SODA (carbonato di sodio), SDS, NaOH. La SODA serve a sciogliere tutto consentendo al SDS (sodio dodecil solfato) di esplicare la sua azione denaturante, intercalandosi tra i residui amminoacidici che costituiscono le proteine. E' da notare che l'aggiunta di SODA insieme ad un composto basico come NaOH o KOH provoca l'idrolisi dell'RNA ma non del DNA, questo perchè l'RNA come acido nucleico è costituito da ribonucleotidi, e a differenza dei deossiribonucleotidi che compongono il DNA, al carbonio 2 dello zucchero presenta un gruppo OH che lo rende particolarmente instabile in ambiente alcalino venendo idrolizzato in una miscela di nucleotidi 2,3-monofosfato, il DNA a differenza dell'RNA è più stabile in ambiente alcalino. A questo punto per ottenere la precipitazione di tutto quello che abbiamo denaturato e del DNA ad alto peso molecolare, si incuba il tutto a 4 gradi per 10 minuti, mediante aggiunta di potassio acetato, questo composto neutralizza il NaOH e la soluzione litica preparata precedentemente consentendo la precipitazione del DNA genomico. Si centrifuga a bassa velocità e si filtra il supernatante su garza per eliminare le proteine ed il DNA genomico. Si precipita il DNA plasmidico con alcool isopropilico, che ha la funzionalità di cambiare la costante dielettrica del mezzo quindi anche gli agganci degli OH con i ponti ad idrogeno e fa precipitare sia RNA che DNA, in parole povere l'alcool rende il DNA insolubile. Il pellet di centrifugazione si sospende in un tampone standard in TE (Tris= idrossimetilamminometano C4H11NO3; e EDTA= etilendiamminatetracetato) tampone con un pH intorno a 7,5-8,0; il Tris viene utilizzato in laboratorio per la preparazione di molti tamponi, mentre l'EDTA è un agente chelante, blocca le nucleasi che potrebbero danneggiare il DNA, distrugge l'attività catalitica di questi enzimi legando gli ioni magnesio che svolgono un ruolo estremamente importante nella funzionalità di tutti gli enzimi che svolgono attività catalitiche nei confronti del DNA; eliminandole si impedisce al DNA di nostro interesse di essere danneggiato. Al tampone si aggiungono poi CsCl, EtBr e si trasferisce tutto in una provetta per ultracentrifugazione. Si ultracentrifuga all'equilibrio e si recupera la banda del DNA plasmidico con una siringa il cui ago viene infilato lateralmente al tubo in corrispondenza della banda di DNA plasmidico che risulta fluorescente, posta tra una superiore di DNA genomico-batterico e una inferiore di RNA. Se durante la procedura il plasmide è stato danneggiato sul gradiente di cesio il plasmide avrà forma rilassata o lineare se il tutto è stato eseguito come si deve lo troveremo in forma superavvolta. A questo punto bisogna eliminare il bromuro d'etidio (EtBr) per pulire il DNA plasmidico e lo si fa mediante estrazione con alcol isoacetilico. A questo poi segue una dialisi contro TE per togliere il bromuro d'etidio e l'alcool. Si legge la soluzione in luce UV a 260 nm per misurare quanto DNA è stato ottenuto e a 280 nm per sapere se è privo di proteine. Infine possiamo verificare lo stato e la purezza del DNA estratto mediante elettroforesi in gel d'agarosio.