ELETTROFORESI

ELETTROFORESI
Con l'elettroforesi è possibile separare in modo preciso e rapido molecole di diversa dimensionalità (piccole molecole proteiche, grandi acidi nucleici, piccoli acidi nucleici e grandi proteine). L'elettroforesi non viene effettuata soltanto in un campo elettrico ma anche in presenza di un tampone ad uno specifico pH, che determinerà la carica delle molecole che si vogliono separare. Fondamentalmente il processo elettroforetico è determinato da 4 fattori:

1) CAMPIONE DA ANALIZZARE: di cui si devono prendere in considerazione tre caratteristiche: CARICA ELETTRICA- DIMENSIONE- FORMA.
a) CARICA ELETTRICA: la velocità di migrazione è proporzionale alla carica netta della molecola e alla grandezza della carica netta. Un ruolo importante lo svolge il pH. Se il pH del mezzo è inferiore al punto isoelettrico della proteina ( o amminoacido) essendo il punto isoelettrico quel valore di pH in corrispondenza del quale la carica netta di un amminoacido è uguale a zero, allora la molecola avrà una carica netta positiva e migrerà verso il catodo (elettrodo negativo). Se il pH sarà pari al punto isoelettrico, la proteina avrà carica netta pari a zero per cui non migrerà ma rimarrà all'origine. Se il pH sarà superiore al punto isoelettrico della proteina, essa sarà carica negativamente e migrerà verso l'anodo ( elettrodo positivo). Ovviamente a seconda del tipo di amminoacidi di cui sarà costituita una proteina, queste avranno una carica netta differente quindi diversi punti isoelettrici e diverse migrazioni in campo elettrico.

b)DIMENSIONE: la velocità di migrazione è inversamente proporzionale al peso molecolare della proteina o molecola, poiché aumentano le forze frizionali ed elettrostatiche rispetto al mezzo circostante.

c)FORMA: le molecole di dimensioni simili ma di forma diversa (tipo proteine fibrose o globulari) mostrano diverse caratteristiche di migrazione a causa delle forze frizionali ed elettrostatiche.

2) un altro fattore importante è il campo elettrico per definire un campo elettrico lo si associa ad una regione di uno spazio in cui una carica è soggetta a forze di natura elettrica. Esiste una relazione tra i fattori di voltaggio, resistenza e corrente, espressa mediante la legge di Ohm : I= V/R dove I= intensità di corrente elettrica, V=voltaggio applicato e R=resistenza del mezzo. Tale legge vuol dire che la corrente elettrica e quindi la velocità di migrazione sono inversamente proporzionale alla resistenza. Quest'ultima dipende dal mezzo di supporto del tipo di tampone e dalla sua concentrazione. Inoltre la resistenza aumenta con l'aumentare della distanza tra gli elettrodi ma diminuisce con l'aumentare sia dell'area della sezione trasversale del supporto, sia della forza ionica del tampone.

3) il tampone, esso determina il pH del supporto e stabilizza sia la velocità di migrazione che la direzione della particella, questo dipende dal fatto che la direzione di migrazione della proteina è determinata dal pH del mezzo elettroforetico. Esistono vari tipi di tampone: FORMIATO, ACETONE, CITRATO, BARRITONE, TRIS FOSFATO, EDTA, PIRIDINA, BORATO= usato per separare gli zuccheri. Una caratteristica fondamentale del tampone è la concentrazione dello stesso tampone , infatti non si devono utilizzare tamponi con elevata forza ionica o bassa forza ionica, Questo perchè il tampone ad alta forza ionica causerà una migrazione del campione più lenta, poiché la corrente è trasportata dagli ioni del tampone maggiormente e non da quelli del campione. Ciò si traduce in una maggiore produzione di calore poichè la corrente trasportata è alta. Invece se il tampone ha bassa forza ionica, il campione migrerà più velocemente poichè la corrente sarà trasportata dagli ioni del campione e non da quelli del tampone ciò si traduce in una minore produzione di calore con conseguente aumento di diffusione e perdita di risoluzione, cioè le bande elettroforetiche non risulteranno chiare come dovrebbero essere. Quindi tra questi due estremi, bisogna scegliere un tampone con caratteristiche intermedie. E' da sottolineare che la dissociazione degli acidi organici aumenta all'aumentare del pH, invece il contrario avviene per le basi organiche, ciò fa sostenere ancora di più che la velocità di migrazione dipende dal pH del mezzo elettroforetico.

Si possono avere due sistemi elettroforetici: 1)SISTEMA CONTINUO: si ha quando il tampone che è usato nelle due vaschette, costituenti l'apparecchio elettroforetico e quello usato nel gel sono gli stessi. 2) SISTEMA DISCONTINUO: si ha quando il tampone usato nelle vaschette e quello usato per saturare il gel sono diversi (caso dell'elettroforesi sul gel in SDS). E' da ricordare che ciò che varia nei compartimenti elettroforetici non è il tampone ma il pH delle concentrazioni.

4)L'ultimo fattore da considerare è il SUPPORTO su cui viene eseguita l'elettroforesi che può essere eseguita su un supporto solido. Essa può essere verticale o orizzontale. La differenza sta anche nel tipo di supporto, perchè la poliacrilammide (verticale) è utilizzata per discriminare le proteine mentre l'agarosio (orizzontale) è usato per gli acidi nucleici. entrambi i supporti sono polimerizzati e danno luogo a delle strutture a 3D a maglie di diverso diametro. Quelle della poliacrilammide hanno un diametro più piccolo di quelle dell'agarosio e pertanto vengono usate per la purificazione delle proteine e di frammenti molto piccoli di acidi nucleici, invece quelle del gel d'agarosio hanno un diametro cospicuo, sono usate per gli acidi nucleici integri o grossi frammenti di essi.