LE REAZIONI SIEROLOGICHE: la reazione di fissazione del complemento

L'insieme degli anticorpi che noi ritroviamo nel siero, nelle secrezioni dell'organismo, rappresentano il prodotto di specifiche reazioni immunitarie. Quando un qualcosa di estraneo al nostro organismo, ad esempio un agente eziologico riesce ad oltrepassare le difese innate, l'organismo risponde, producendo gli anticorpi che hanno lo scopo di reagire in maniera specifica, altamente specifica, con alcune componenti strutturali appartenenti al microrganismo e che ne hanno innescato la produzione. Ciò a sua volta indurrà determinate azioni, che permetteranno all'organismo di eliminarlo, sempre se tutto va per il verso giusto si intende.

Se cimentiamo il siero di un animale (vertebrato) immune nei confronti di un determinato antigene, la reazione specifica tra l’anticorpo diretto nei confronti dell’antigene che ne ha evocato la formazione porterà ad un prodotto, costituito dall'interazione specifica tra l'anticorpo e l'antigene verso il quale è diretto; prodotto macromolecolare che in gergo immunobiologico viene definito immunocomplesso (antigene-anticorpo).

Noi possiamo sfruttare, nella pratica di laboratorio, questa caratteristica peculiare del sistema immunitario, possiamo sfruttare la sua specificità d’azione. La formazione di un immunocomplesso in vitro può essere accompagnata da fenomeni direttamente apprezzabili ad occhio nudo o può, a seconda dei casi, essere rilevato in maniera indiretta, mediante specifici artifici di laboratorio. 

Nell’uno o nell’altro caso la formazione di un immunocomplesso può essere sfruttato a scopi diagnostici mediante specifiche reazioni sierologiche.
“Una reazione sierologica quindi è una reazione in cui un siero immune, o presunto tale, viene cimentato con un antigene e nella quale la formazione dell’immunocomplesso può essere individuata direttamente o indirettamente.”
I reagenti fondamentali quindi, se non lo si fosse capito, sono due, il siero immune (contenente anticorpi specifici) e l’antigene (verso il quale l’anticorpo è diretto in maniera specifica).
Nelle reazioni sierologiche uno dei due reagenti deve essere sempre noto. Ciò teoricamente, determina che le reazioni sierologiche siano tutte ambivalenti e cioè:

• Disponendo di un siero immune noi possiamo dimostrare la presenza di uno specifico antigene in un determinato materiale di nostro interesse. 
• Disponendo di uno specifico antigene, possiamo dimostrare in un siero di nostro interesse la presenza dell’anticorpo diretto nei suoi confronti. 

Quando si eseguono reazioni sierologiche come vedremo, si è soliti usare delle tecniche semiquantitative. Il loro scopo è quello di permetterci di titolare una quantità relativa di anticorpi presenti in un siero o di antigene presente in un determinato materiale. Per farlo è buona norma cimentare delle diluizioni progressivamente crescenti del reagente in esame con quantità fisse, costanti, del reagente noto. Un esempio è il titolo anticorpale. Preleviamo il siero del paziente, lo trattiamo adeguatamente a seconda della metodica che andremo ad eseguire, allestiamo varie diluizioni di tale siero (1:100-1:200-1:400 ecc..) e poi andremo a verificare a quale diluizione osserviamo ancora la risposta immunitaria.

Il titolo anticorpale quindi lo definiremo come l'inverso della più bassa concentrazione (o della più alta diluizione) del siero del paziente che mantiene ancora attività rilevabile nei confronti di un antigene noto. 

Di reazioni sierologiche ne abbiamo di vari tipi, in questo e in altri post vedremo alcune delle più comuni e famose: 

Reazione di fissazione del complemento. 
Ricordiamoci sempre che le reazioni sierologiche sfruttano la specificità d'interazione tra un anticorpo e l'antigene verso il quale tale anticorpo è diretto in maniera altamente specifica; poco prima abbiamo detto che la formazione dell'immunocomplesso (anticorpo+ antigene) può essere evidenziabile direttamente attraverso reazioni o fenomeni visibili ad occhio nudo o essere individuata e quindi dimostrata indirettamente, attraverso alcuni artifici di laboratorio.
Infatti in alcuni contesti non è possibile evidenziare direttamente l’avvenuta formazione dell’immunocomplesso, quindi si deve ricorrere ad altri stratagemmi, uno di questi è la reazione di fissazione del complemento, grazie alla quale si può dimostrare indirettamente l’avvenuta formazione dell’immunocomplesso.
Il complemento, molto brevemente, è un complesso sistema di molecole, fattori e componenti proteiche presenti nel siero dei vertebrati, che viene attivato letteralmente a cascata quando gli anticorpi si legano ad un antigene. Qualora tale antigene, sia rappresentato da un elemento cellulare, le componenti del complemento sono in grado di indurre sulla superficie della cellula estranea, qualora l'antigene sia costituito da un elemento corpuscolato, quindi una cellula, legata dall’anticorpo, la formazione di veri e propri pori che determineranno la morte della cellula estranea per lisi cellulare. Sia chiaro, il complemento non si attiva solo ed esclusivamente in presenza di anticorpi ma è un qualcosa che vedremo nei prossimi post. Ritornando al nostro discorso, noi possiamo in laboratorio sfruttare la capacità del complemento di fissarsi e quindi di consumarsi attraverso il legame ad un immunocomplesso.
Questa reazione sierologica ci permetterà di andare alla ricerca di immunocomplessi, anticorpi diretti contro specifici antigeni macromolecolari solubili, che per vari motivi non è possibile evidenziare in altri tipi di reazioni sierologiche, come le reazioni di agglutinazione, emoagglutinazione passiva ecc…e in cui l’avvenuta formazione dell’immunocomplesso non può essere rilevata direttamente.
Reagenti fondamentali in una reazione di fissazione del complemento sono quindi:

• L'antigene.
• L’anticorpo diretto in maniera specifica nei suoi confronti.
• Il complemento che dovrà legarsi all’immunocomplesso (antigene-anticorpo) di nostro interesse.
• Il sistema rivelatore, costituito da cellule di cui sia facile apprezzare la lisi cellulare (es.globuli rossi) e anticorpi diretti in maniera specifica contro di essi.

La presenza del sistema rivelatore è fondamentale, ci aiuta a capire se l’immunocomplesso si è formato e se quindi nel siero in esame erano presenti oppure no l’anticorpo o l’antigene di nostro interesse. Infatti se tale immunocomplesso si sarà formato, il complemento aggiunto a tale siero si fisserà completamente ad esso e non sarà disponibile a legarsi con il secondo immunocomplesso (rivelatore). La mancata lisi del sistema rivelatore darà esito positivo, se osserveremo la lisi del sistema rivelatore l’esito sarà negativo. Significa che nel siero non vi erano presenti anticorpi diretti contro l’antigene e il complemento non si era fissato ad alcun immunocomplesso.

Una reazione di fissazione del complemento è quindi una reazione sierologica in cui: “un siero immune o presunto tale, viene cimentato con un antigene in presenza di concentrazioni note e piccole di complemento e in cui la formazione dell’immunocomplesso può essere evidenziata dimostrando l’avvenuta fissazione del complemento all’immunocomplesso.”

La reazione è più facile da eseguire che da spiegare. Possiamo suddividerla in vari stadi.

Come primo passo bisogna eliminare il complemento dal siero di nostro interesse, è presente in quantità a noi ignota, potrebbe reagire non solo con l’immunocomplesso che a noi interessa rilevare ma anche con l’immunocomplesso rivelatore lisandolo, ciò non potrebbe che inficiare il responso dell’indagine. Per eliminare il complemento bisogna denaturare le sue componenti proteiche, il trattamento termico del siero in esame rappresenta il trattamento elitario da questo punto di vista. In genere il siero viene sottoposto a temperature di circa 56°C per 30 minuti. Gli anticorpi a questa temperatura non vengono denaturati e la loro struttura e di conseguenza la loro funzionalità non viene compromessa.

Si eseguono delle diluizioni scalari del siero a cui viene aggiunta una quantità fissa di antigene e a ciascuna miscela viene aggiunta una quantità di siero fresco di cavia di cui si era titolata l’attività complementare. 
Il complemento aggiunto sarà presente in un quantitativo limitato. Le miscele vengono incubate per un tempo sufficiente a permettere che le componenti presenti reagiscano adeguatamente, portando alla formazione dell’immunocomplesso di nostro interesse e di conseguenza, se questo si è formato, alla fissazione del complemento.
Trascorso questo periodo di tempo dobbiamo accertarci che si sia formato l’immunocomplesso e la fissazione del complemento; per farlo utilizziamo il sistema rivelatore costituito da emazie (di cui è facile apprezzare la lisi) e gli anticorpi diretti contro tali emazie. Si aggiunge ad ogni miscela una quantità standard di emazie di pecora trattate con il rispettivo antisiero (la cosiddetta miscela emolitica) si incuba a temperatura e tempo adeguate (37°C per 20-30 minuti).
 Se il primo immunocomplesso si è formato il complemento avrà reagito tutto legandosi ad esso e non sarà disponibile a reagire con il sistema rivelatore, altrimenti in caso contrario sarà ancora libero e liserà le emazie dando esito negativo.
 La reazione di fissazione del complemento può mostrare una minore sensibilità rispetto ad altre reazioni di tipo sierologico, come ad esempio le reazioni di emoagglutinazione passiva. Non dimentichiamoci inoltre che gli anticorpi, in particolar modo anche gli anticorpi di classe IgM sono particolarmente efficaci nello stimolare l’attivazione del complemento. Dal momento che tali classi anticorpali sono prodotte proprio nelle prime fasi di un’infezione, spesso i titoli anticorpali più elevati, dimostrabili con la fissazione del complemento, sono quelli che si osservano nei campioni di siero prelevati durante le prime fasi di un’infezione dove le IgM sono presenti in concentrazioni maggiori.