IL CLONAGGIO DEL DNA

I genomi di animali, piante e microrganismi sono troppo grandi per essere analizzati con tecniche di laboratorio come gli enzimi di restrizione e l'elettroforesi su gel che ci forniscono un metodo per analizzare semplici molecole di DNA. Nei post precedenti abbiamo descritto come si misura la lunghezza dei frammenti di restrizione; se prendiamo ad esempio il genoma dell'Escherichia coli, costituito da circa 4200 kb, la digestione di questo genoma con l'enzima di restrizione EcoRI produrrebbe all'incirca 1000 frammenti e come abbiamo, quello umano circa 700 000 diversi frammenti. Insomma il punto è che se noi sottoponessimo questi frammenti all'analisi elettroforetica quello che osserveremmo non sarebbero delle bande distinte ma uscirebbe una strisciata (smear) difficile da interpretare. Ecco allora che per analizzare ogni frammento è necessario prima di tutto purificarli uno a uno e poi amplificarli, cioè produrre molte copie identiche di ogni singolo frammento purificato. Vi sono due tecniche che consentono di portare a termine questo compito: 1) è il clonaggio del dna con cui vengono amplificati frammenti di dna. 2) La PCR con cui si può purificare e amplificare frammenti di DNA di nostro interesse più velocemente di quanto si possa fare con il clonaggio del DNA.

Come funziona il clonaggio del DNA?

Il processo può essere suddiviso in varie tappe:

1)INSERIRE I FRAMMENTI DI RESTRIZIONE IN VETTORI DI CLONAGGIO

I frammenti di DNA non possono riprodursi da soli, per rendere possibile la loro replicazione devono essere inseriti in un vettore, una sequenza specializzata di DNA che può entrare in una cellula e replicarsi. Esistono molti tipi di vettori e ognuno di essi ha la caratteristica di comportarsi come un cromosoma in grado di accettare DNA esogeno come inserto e di replicarsi nell'ospite in modo indipendente dal genoma di quest'ultimo. L'unione del vettore con l'inserto (che sono sequenze di DNA di diversa origine) produce una molecola di DNA ricombinante. Un ruolo importante nell'inserimento di una sequenza di DNA all'interno di un vetore quale un plasmide lo svolgono gli enzimi di restrizione. Come descritto in precendenza gli enzimi di restrizione portano alla formazione di estremità coesive tagliando il DNA in particolari punti della sequenza nucleotidica. A prescindere dal tipo di DNA (batterico o umano) le estremità coesive prodotte con lo stesso enzima di restrizione hanno sequenze complementari. Quindi si può tagliare il vettore con un enzima di restrizione utilizzato per produrre frammenti di DNA genomico e mischiare insieme il vettore digerito e i frammenti, in presenza della DNA ligasi. In seguito basta dare il tempo alle estremità coesive di entrare in contatto e alla ligasi di stabilizzare i legami, attraverso la formazazione di legami tra gli scheletri zucchero-fosfato portando alla formazione di un vettore contenente il gene di interesse che si vuole clonare.

2) AMPLIFICAZIONE DEI VETTORI E LORO INSERTI
Dal momento che esistono diversi tipi di vettori ognuno con caratteristiche ben definite è possibile descrivere uno schema generale, che ci può aiutare a capire il modo in cui i vettori entrano nella cellula e sfruttano l'ambiente cellulare per replicarsi. Possiamo suddividere questo processo in più tappe: selezione delle cellule che hanno ricevuto il vettore, distinzione tra cellule che hanno il vettore con l'inserto e quelle che hanno solo il vettore senza l'inserto. Un classico esempio di vettore è il plasmide, molecola circolare di DNA che gli consente di essere un ottimo vettore di clonaggio dal momento che permette al gene clonato di essere propagato all'interno della cellula ospite. Infatti i plasmidi si replicano efficientemente nelle cellule batteriche dal momento che possiedono delle proprie origini di replicazione che viene riconosciuta dalla DNA polimerasi batterica e quindi replicato. Di conseguenza il macchinario deputato alla replicazione del DNA replica il plasmide e il gene di nostro interesse contenuto al suo interno. Anche i genomi dei fagi batterici possono essere utilizzati come vettori di clonaggio poichè anch'essi possiedono delle origini di replicazione che gli consentono di propagarsi all'interno dei batteri, utilizzando gli enzimi dell'ospite come la DNA polimerasi o altri enzimi e proteine specificate dai geni del fago stesso.

UN ESEMPIO DI VETTORE: PLASMIDE pBR322.

Uno dei primi vettori plasmidici ad essere utilizzati è stato il pBR322, questo plasmide fu costruito legando insieme tre frammenti di restrizione provenienti da tre plasmidi naturali dell E. coli: R1, R6,5 e pMB1. Questo plasmide di piccole dimensioni contiene oltre all'origine di replicazione due geni in grado di codificare enzimi che permettono al batterio di resistere a due antibiotici, l'ampicillina e la tetraciclina. Perchè è necessaria la presenza di questi geni? Perchè questi geni sono dei marcatori di selezione! La loro funzione è quella di permettere al ricercatore di distinguere le cellule che contengono il plasmide pBR322 da quelle che ne sono prive. Le cellule vengono piastrate su un terreno di agar contenente ampicillina e tetraciclina. Le cellule che non contengono il plasmide e di conseguenza i geni per la resistenza non possono crescere in un terreno contentene questi antibiotici. Come inseriamo il plasmide all'interno dei batteri? Sfruttando un processo naturale cioè la trasformazione, processo che consente ai batteri di assumere DNA nudo dall'ambiente esterno. Purtroppo non è un processo molto efficiente in quanto solo una frazione molto piccola di cellule assumerà DNA dall'ambiente esterno. Però l'assunzione di DNA da parte dei batteri può essere migliorata in vari modi. Ad esempio le molecole di DNA ricombinante sono aggiunte ad una sospensione di E.coli opportunamente trattata. Sospendendo le cellule in una soluzione di CaCl2 freddo, oppure sottoponendole a shock elettrico con scariche ad alto voltaggio (tecnica conosiuta con il nome di elettroporazione). Tutto questo dovrebbe favorire l'ingresso del vettore che così entrerà all'incirca in 1 cellula su 1000. Questo metodo dovrebbe aumentare la permeabilità della membrana plasmatica dei batteri producendo in sostanza dei pori temporanei attraverso i quali il DNA può entrare. Nonostante tutto la possibilità che un vettore entri in una cellula rimane comunque bassa. Ecco perchè i marcatori di selezione come i geni di resistenza agli antibiotici che abbiamo accennato poc'anzi sono così importanti, perchè permetteranno di selezionare quel ristretto numero di cellule batteriche che hanno acquisito il vettore!
L'origine di replicazione del plasmide permetterà alla molecola ricombinante di replicarsi indipendentemente dal genoma batterico, infatti molti plasmidi si replicano talmente tante volte che una singola cellula può contenere centinaia di copie identiche dello stesso plasmide. A sua volta ogni cellula batterica che conterrà questo plasmide si replicherà producendo una colonia di decine di milioni di cellule geneticamente identiche. Colonia che nell'insieme è nota come clone cellulare. Questi cloni sono ben visibili sulla piastra di agar perchè formano delle macchie di circa 1 mm di diametro, mentre le cellule senza plasmide rimangono disseminate sulla piastra senza formare colonie. I milioni di molecole identiche all'interno di una colonia formano un clone di DNA. E' da osservare che il vettore pBR322 mostra all'interno del plasmide delle sequenze di riconoscimento per sette enzimi di restrizione ciascuno dei quali taglierà il plasmide in un particolare sito.

Sei di questi siti si trovano all'interno dei geni per la resistenza agli antibiotici ampicillina e tetraciclina, ciò significa che se il gene che vogliamo clonare si inserirà in uno di questi sei siti, il plasmide perderà la capacità di conferire alla cellula ospite resistenza all'ampicillina o alla tetraciclina. In questo caso si parla di inattivazione inserzionale, strategia utilizzta per individuare il plasmide ricombinante, quello che contiene il frammento di dna inserito nel vettore, da un plasmide non ricombinante, che è entrato nella cellula ospite ma che non ha subito l'inserzione del gene che si desidera clonare.