WESTERN BLOTTING

Il western blotting è una metodica analoga al southern e all'nothern blotting  usata per rilevare una proteina specifica in una miscela complessa che vogliamo analizzare.

• è un test particolarmente sensibile ed efficace.
• svantaggi: è molto costoso e poco pratico da applicare

Per prima cosa si deve ottenere un campione della proteina di nostro interesse che si desidera analizzare, ciò lo si può ottnere ad esempio da campioni di cellule. Le cellule vengono opportunamente lisate in modo tale da ottenere il contenuto proteico. In seguito si effettua un elettroforesi su gel in modo tale che le proteine vengano separate in base alle dimensioni. Le proteine devono essere trasferite dal gel su una membrana  di nitrocellulosa usando l'elettricità, il trasferimento non avviene per capillarità come nel caso del southern o del nothern. Questa membrana può quindi essere utilizzata per sondare le proteine di interesse utilizzando un anticorpo.

L'anticorpo ci serve per rilevare la proteina di nostro interesse tra le migliaia di proteine sul gel!

 E' possibile visualizzare la proteina direttamente sulla nitrocellulosa usando un metodo colorimetrico.

In seguito la separazione elettroforetica delle proteine è resa possibile sotto l'influenza di un campo elettrico applicato. La migrazione delle proteine avviene in base al loro peso molecolare; e non si esplica per capillarità come nel nothern o southern blot. Può essere usato l'SDS per denaturare le proteine.

Con il western blot qualsiasi campione di proteine proveniente da tessuti o cellule e le proteine ricombinanti sintetizzate in vitro. L'efficacia del processo dipende anche dal tipo di anticorpo che andiamo ad utilizzare per la proteina di nostro interesse e quanto è specifico per essa. Sono fondamentali ai fini della riuscita di questa tecnica, in quanto l'anticorpo ci permette di distinguere tra le migliaia di proteine presenti nel campione di analisi quella che ci interessa.

Come si può vedere nel disegno illustrativo sotto, nel primo passaggio otteniamo le proteine di nostro interesse, le possiamo prelevare da campioni di cellule per esempio. Le cellule vengono lisate in modo tale da rilasciare le proteine. In seguito le proteine raccolte vengono fatte "correre" sul gel tramite elettroforesi, in modo tale da separarle in base al peso molecolare. Le proteine una volta separate saranno trasferite su una membrana tramite l'utilizzo di elettricità.

Altro elemento essenziale per la riuscita del western blot è la presenza di anticorpi che servirà per rilevare la proteina che ci serve tra le migliaia presenti. Dopo aver utilizzato l'anticorpo primario che ha legato le proteine di nostro interesse, si utilizza in seguito un anticorpo secondario in grado di poter rilevare il primo. Si viene a creare un vero e proprio sandwich (proteina-anticorpo primario-anticorpo secondario). L'anticorpo secondario ha ad esso associato un enzima, in grado di poter catalizzare una reazione in cui un substrato specifico viene poi convertito in un prodotto luminoso.

La luce rilasciata da questo composto viene evidenziata può essere evidenziata come una macchia sulla pellicola; macchia che ci permette di individuare la proteina che stiamo ricercando.

MOTIVI DI LEGAME ALL'RNA.

Nel post precedente ho accennato ai motivi di legame delle proteine al DNA. Domanda: esistono motivi di legame all'RNA? la risposta è si. Inevitabilmente esistono proteine in grado di legarsi all'RNA, e tali proteine come nel caso di quelle che si legano al DNA hanno specifici motivi che ne permettono un'interazione tra le componenti amminoacidiche delle proteine e i nucleotidi dell'acido nucleico in questione.

I principali, o una parte di tali motivi sono:

• Il dominio ribonucleoproteico (RNP): comprende quattro foglietti beta e due alfa eliche nell'ordine beta-alfa-beta-beta-alfa-beta. I due foglietti beta centrali formano il legame con la molecola di RNA. Questo dominio è il motivo di legame all'RNA più comune.
• Il dominio di legame all'RNA a doppio filamento (dsRBD): simile al dominio precedente, ma con una struttura alfa-beta-beta-beta-alfa. La sua funzione di legame al DNA è localizzata tra beta e alfa, alla fine della struttura. Come indica il nome, il motivo si ritrova in proteine che legano l'RNA doppio filamento.
• Il dominio di omologia k: ha la struttura beta-alfa-alfa-beta-beta-alfa, con la funzione di legame situata tra la coppia di alfa-eliche. Non è molto comune.
• L'omeodominio: lega il DNA, in alcune proteine può avere anche un attività di legame all'RNA. In particolare, una proteina ribosomale utilizza una struttura simile all'omeodominio per legare l'rRNA e alcune proteine a omeodominio come Bicoid di Drosophila melanogaster in grado di legare entrambi gli acidi nucleici.

L'IMPORTANZA DELLE PROTEINE CHE LEGANO IL DNA.

L'espressione del genoma; in genere si usa un termine per indicare tale processo o parte di esso: trascrizione,  molto spesso avrete sentito dire " il DNA fa l'RNA." Quando si parla di trascrizione però bisogna prendere in considerazione che i processi che sono coinvotli nella formazione del cosidetto trascrittoma; del passaggio da genoma a trascrittoma, sono processi veramente molto più complessi della sola sintesi di RNA.

Possiamo suddividere per comodità questo processo in due fasi.

1) Inizio processo della trascrizione: si tratta della formazione di un vero e assemblamento di proteine, tra essi abbiamo l'RNA polimerasi e tutte le proteine accessorie, nella regione a monte del gene prima di copiarlo in un trascritto di RNA: In questo stadio sono coinvolti gli eventi che stabiliscono se il gene deve essere espresso oppure no in un determinato momento del ciclo cellulare.

2)Sintesi e maturazione dell'RNA: processo che inizia nel momento in cui l'RNA polimerasi lascia la regione definita di inizio e inizia a sintetizzare una copia ad RNA del gene sottoposto a questo processo; termina dopo che sono completati la maturazione e gli eventi di modificazione che convertono il trascritto inziale in un RNA funzionante e proprio ad essere utilizzato.

Le proteine di legame al DNA, che legano il genoma per svolgere le varie funzioni a carico del depositario dell'informazione genetica, svolgono un ruolo di fondamentale importanza. Infatti il loro ruolo è di cruciale importanza affinchè possa avvenire il processo della trascrizione.

Tali proteine per legarsi al DNA devono essere in grado di riconoscere una sequneza nucleotidica specifica e quindi di legare un numero limitato di posizioni sulla molecola di DNA, dal momento che questo è il tipo di interazione più importante per l'espressione del genoma.

Per legarsi alla sequenza nucleotidica la proteina deve essere in grado di riconoscere la sequenza su cui deve esplicare la sua funzione. Dobbiamo considerare che la molecola del DNA possiede una struttura a doppia elica, ne consegue che la proteina deve riuscire a penetrare nel solco maggiore o minore, per leggere direttamente la sequenza.

Attraverso gli studi effettuati sulle proteine in grado di legarsi al DNA  in maniera sequenza-specifica, è stato scoperto che la famiglia di proteine nel suo insieme, può essere suddivisa in un numero ristretto di gruppi, in base alla struttura della regione della proteina che interagisce con la molecola di DNA: ciascuno dei motivi di legame al DNA è presente in un ampia varietà di proteine provenienti spesso da organismi diversi e almeno alcuni di essi si sono probabilmente evoluti più di una volta.

Due esempi sono il motivo elica-giro-elica, e il motivo a dito di zinco.

Elica-giro-elica.

E'un motivo proteico che ritroviamo sia in cellule procariotiche che eucariotiche. Questo motivo proteico indicato dalla sigla HTH (helix-turn-helix). Come suggerisce il nome, il motivo, è caratterizzato da due alfa eliche separate da un giro, quest'ultima non è una conformazione casuale ma una struttura specifica, nota come giro beta, costituito da almeno 4 amminoacidi di cui il secondo è una glicina.

Questo giro insieme alla prima alfa elica posiziona la seconda alfa elica sulla superficie della proteina, in un orientamento che gli consente di inserirsi all'interno del solco maggiore del DNA. In poche parole tale elica rappresenta quella di riconoscimento, è coinvolta nel donfamentale contatto per la lettura diretta della sequenza del DNA. La struttura HTH comprende circa 20 amminoacidi, quindi rappresenta solo una piccola porzione della proteina. Altre regioni della proteina interagiscono con la superficie della molecola del DNA, per assistere al posizionamento corretto dell'elica di riconoscimento all'interno del solco maggiore. Nei batteri questi motivi strutturali, sono coinvolte nel funzionamento dei geni più studiati, uno su tutti il repressore del lattosio.

Negli eucarioti troviamo vari tipi di motivi HTH: dominio POU e il dominio elica-giro-elica alato quest'ultimo è una versione estesa del dominio elica giro elica con una terza alfa elica ad un lato del motivo HTH e un foglietto beta all'altro. Ovviamente nonostante le proteine eucariotiche e procariotiche contengano un motivo HTH le interazioni tra l'elica di riconoscimento con il solco maggiore non sono esattamente le stesse. La lunghezza dell'elica di riconoscimento ad esempio varia ed è più estesa nelle proteine eucariotiche.

Molte HTH negli eucarioti sono importanti nell'espressione genica durante lo sviluppo, come le proteine a omeodominio. L'omeodominio presenti in queste proteine è un dominio HTH esteso. Ritorneremo a brevissimo sulle caratteristiche di queste proteine.

SEGMENTAZIONE: Anfiosso.

L'anfiosso è un cefalocordato, una breve descrizione la potete trovare sul post di Biosproject: earth del mese di febbraio: urocordati e cefalocordati.

Perchè studiare la segmentazione dell'anfiosso?

La risposta è presto data, prove di natura genetica e molecolare associate a dati paleontologici sembrano corroborare un modello filogenetico che individua l'anfiosso come la categoria sistematica più vicina ai vertabrati. Per tale motivo sembra utile e di rilevante importanza studiare i meccanismi di sviluppo di questo organismo che è il principale rappresentante dei cefalocordati.

SEGMENTAZIONE: riccio di mare.

Dopo la fecondazione lo zigote è pronto per entrare nel successivo stadio del ciclo vitale. La segmentazione. Le uova dell'echinoderma riccio di mare sono isolecitiche, quindi vanno incontro a segmentazione oloblastica, cioè la formazione del solco di segmentazione coinvolgerà completamente lo zigote.

Il primo piano di segmentazione è meridiano e attraversa il polo animale-vegetativo, il fuso mitotico è disposto all'equatore della cellula ed è orientato perpendicolarmente all'asse animale vegetativo, lo zigote viene suddiviso in due cellule (blastomeri) di uguali dimensioni.

SEGMENTAZIONE: Ascidia

L'ascidia appartiene al gruppo dei tunicata (urocordati) una descrizione viene data su Biosproject: Earth al seguente link: Urocordati e cefalocordati.

L'ascidia porta avanti una segmentazione oloblastica di tipo bilaterale riportato nell'immagine sotto.

LA SEGMENTAZIONE: caratteristiche generali.

Per quanto sia straordinario il processo della fecondazione non è che l'inizio dello sviluppo di un nuovo organismo. Dopo l'avvenuta fusione tra spermatozoo e cellula uovo, lo zigote (termine con il quale indichiamo la cellula uovo fecondata) va incontro ad un processo noto come segmentazione, durate il quale l'enorme volume citoplasmatico della cellula uovo viene suddiviso in numerose cellule nucleate più piccole. Al processo della segmentazione seguirà lo stadio noto come gastrulazione durante il quale le cellule derivate dal processo di segmentazione andranno incontro a drammatici movimenti facendo si che tali cellule acquisiscano nuove relazioni spaziali.

Durante la segmentazione e la gastrulazione si verificano quindi importanti eventi che permetteranno la formazione dei tre assi embrionali:

1)l'asse antero-posteriore detto anche cefalocaudale.

2) L'asse sinistra-destra.

3)l'asse dorso-ventrale.

FUSIONE MEMBRANA SPERMATOZOO.-CELLULA UOVO ...E QUALCHE ALTRA INFORMAZIONE SULLA POLISPERMIA

Ecco il primo post di Biosproject del 2012, si lo so sono un poco in ritardo, sono passati una decina di giorni dall'inizio dell'anno; ma volevo organizzarmi bene, i buoni propositi per il blog sono tanti, speriamo di rispettarli.

Da oggi a domenica, vorrei proporvi una serie di post con il quale concludere il discorso della fecondazione iniziato qualche post fa.

AUGURI DI BUON NATALE!

                                      Tanti auguri di Buon Natale a tutti i lettori di Biosproject !

INIBIZIONE DELLA POLISPERMIA.

Nel post precedente avevamo accennato ai vari meccanismi che nel riccio di mare e nei mammiferi determinano il riconoscimento e la fusione delle membrane dello spermatozoo e della cellula uovo. Una volta avvenuta la fecondazione, la propensione della cellula uovo ad essere fecondata diventa pericolosa.  Con la fusione tra spermatozoo e cellula uovo e l'unione dei loro nuclei aploidi viene ripristinato il normale corredo cromosomico della specie. Ne consegue che fecondazioni secondarie porterebbero ad uno squilibrio nel numero di cromosomi, con effetti deleteri sullo sviluppo di un nuovo organismo. Infatti esiste un particolare processo che impedisce fecondazioni secondarie; ed è noto come inibizione della polispermia.

Inoltre lo spermatozoo oltre al nucleo aploide fornisce all'uovo anche il centriolo.

Nella normale monospermia, in cui nell'uovo penetra un solo spermatozoo, il centriolo fornito da quest'ultimo va incontro a divisione per formare i due poli del fuso mitotico di segmentazione.

Grazie ad esso la cellula si divide in due nella prima divisione mitotica che determina l'inizio della segmentazione.

L'ingresso di più spermatozooi è noto con il termine di polispermia e in genere ha conseguenze che, come accennato precedentemente, sono distratrose per lo sviluppo del nuovo organismo. Facciamo un esempio: supponiamo che siano due gli spermatozooi a fecondare una cellula uovo, ciò che ne deriva è un nucleo triploide, cioè ogni cromosoma risulta presente in triplice copia anzichè in due, inoltre saranno presenti due centrioli, e dopo che si saranno divisi ne saranno presenti 4; la cellula non contiente istruzioni che le permettano di risolvere questo genere di problemi, non esistono meccanismi che permetteranno una corretta segregazione dei cromosomi nelle cellule che si formeranno, ne nel numero e nel tipo corretto di cromosomi, ciò che ne deriva saranno cellule contenenti un eccesso di geni e cellule contenenti meno cromosomi del necessario.

Gli organismi hanno sviluppato svariate strategie per imperdire fecondazioni secondarie possiamo

Blocco rapido alla polispermia.

E' caratterizzato da un cambiamento nel potenziale di membrana che impedisce agli spermatozooi di interagire con la superficie dell'uovo. Prendiamo come punto di riferimento anche in questo caso il riccio di mare. Come accennato l'importante ruolo della membrana della cellula uovo è quella di mettere in relazione tale cellula con lambiente circostante, ciò fa si che la concentrazione degli ioni ella cellula uovo differisca enormemente da quella dell'ambiente circostante nel quale è immerso. Tale differenza è particolarmente significativa per quanto riguarda gli ioni sodio e potassio. La concentrazione dello ione sodio è di gran lunga più elevata nell'ambiente marino esterno che in quello cellulare, mentre per il potassio il discorso vale all'inverso. Tale condizione (non parleremo qua di quali meccanismi mantengono continuamente tale differenza di concentrazioni tra i due lati della membrana), viene mantenuta dalla membrana cellulare che continuamente impedisce l'ingresso degli ioni sodio e l'uscita del potassio. Se si inserisce un elettrodo all'interno dela cellula uovo e si colloca un secondo elettrodo al di fuori di esso si può misurare la differenza di potenziale tra i due lati che in genere ha un potenziale di -70mV; con l'interno della cellula più negativo rispetto all'esterno.

Dopo il legame con lo spermatozoo e la relativa fusione delle membrane delle cellule germinali, il potenziale di membrana si modifica assumendo un valore di circa + 20 mV circa. La variazione del potenziale di membrana è dovuta ad un ingresso di ioni sodio nell'uovo. E' stato osservato che gli spermatozooi sembrano essere in grado i legarsi alla membrana della cellula uovo quando essa presenta un potenziale d imembrana di -70 mV, mentre non sembrano in grado di legarsi a membrane delle cellule uovo che presentano un potenziale di riposo positivo. L'importanza degli ioni sodio e della loro influenza sull'entrata degli spermatozooiè stata ampiamente accertata attraverso vari esperimenti, e si è visto che il blocco rapido viene rimosso se nella soluzione in cui sono inseriti i ricci di mare la concentrazione degli ioni sodio viene ridotta notevolmente, anche mantenendo la membrana con un potenziale negativo non vi era blocco. Non si conoscono con precisione i meccanismi che impediscono algi spermatozooi di entrare in una cellula uov una volta che il suo potenziale di membrana è diventato positivo. Molto probabilmente la presenza di proteine con carica netta positiva a cui viene impedito il legame con componenti della cellula uovo.

Blocco lento alla polispermia.

Il blocco rapido alla polispermia non è eterno, la modificazione del potenziale di membrana dura per breve tempo. Entro un minuto infatti la membrana tende a tornare nuovamente al suo stato di riposo, ciò comporta un ritorno della membrana ad essere potenzialmente fecondata da altri spermatozooi, per evitare che questo avvenga e rimuovere eventuali spermatozooi che si legano nuovamente alla superficie, si innesca un secondo processo noto come blocco lento alla polispermia. Evento principale è l'esocitosi dei granuli corticali.

Come accennato nel post precedente nel riccio di mare i granuli corticali sono migliaia, possiedono enzimi, proteine ialine, mucopolisaccaridi ecc...

Viene definito blocco lento in quanto si instaura circa un minuto dopo l'avvenuta fusione dello spermatozoo con la cellula uovo. Quando lo spermatozoo entra questi granuli corticali si fondono con la membrana plasmatica dell'uovo e liberano il loro contenuto nello spazio compreso tra la membrana cellulare e la membrana vitellina. Sono diverse le proteine che vengono rilasciate, una di esse è la serinproteasi dei granuli corticali, un enzima simile alla tripsina. La sua funzionalità è quella di interrompere le connessioni proteiche esitenti tra la membrana cellulare e la membrana vitellina. consentendo in tal modo un distacco dei recettori della bindina con tutti gli spermatozooi ad essi associati. In secondo luogo i mucopolisaccaridi rilasciati dai dai granuli corticali determinano un gradiente osmotico che richiama acqua determinando un rigonfiamento nello spazio tra la membrana vitellina e quella cellulare facendo rigonfiare la membrana vitellina e iniziando in questo mo quel processo noto come formazione della membrana di fecondazione. Altre proteine rilasciate dai granuli corticali sono enzimi come la perossidasi che rende più resistente la membrana di fecondazione stabilndo legami crociati tra i residui di tirosina di proteine adiacenti. La membrana di fecondazione inizia a formarsi nel punto di ingresso dello spermatozoo e continua a formarsi avvolgendo l'intera cellula uovo, durante la sua formazione gli spermatozooi si distaccano dalla cellula. Le proteine ialine svolgono un altro ruolo importante in quanto forma un rivestimento attorno alla cellula uovo. Inoltre durante questo processo la cellula uovo emette lunghi microvilli che daranno sostegno alle future cellule durante il processo della segmentazione.

CARNEVALE DELLA BIODIVERSITA' VI: IL BANDO

È arrivato Dicembre e come tutti sapete sta per arrivare una data importantissima. Natale? Ma no! Qualcosa di molto più interessante e che comporta molti meno regali: la VI edizione del carnevale della Biodiversità si terrà infatti tra pochissimo, il 12 Dicembre.
Una caratteristica in comune col Natale però questo carnevale ce l'ha: ha a che fare coi parenti. Il tema, come sempre provocatorio per stimolare l'inventiva di chi scrive e la curiosità di chi legge, sarà infatti:



                                                         PARENTI SERPENTI

...e il blog ospite sarà il popolarissimo Oggiscienza.
Sssssssiamo molto curiosi di vedere cosa ci aspetta in questa sssssesta edizione! Ecco intanto i link alle passate edizioni:
Carnevale della biodiversità:
I) Infinite forme bellissime
II) Biodiversià e adattamenti
III) Le dimensioni contano
IV) Alieni tra noi
V)Nicchie estreme: ai confini della realtà


FAQ:

D. Ho un blog in cui parlo di biologia e vorrei partecipare, come faccio?
 R. Semplice, manda una email di adesione a questo indirizzo e il comitato direttivo valuterà la candidatura (per mantenere alti gli standard siamo costretti a fare una minima selezione, della qual cosa ci sentiamo comunque molto in colpa). Chi ha già partecipato verrà invece contattato in privato dal Comitato.

D.Non ho mai partecipato alle precedenti edizioni, posso partecipare a questa?
R. Certamente, tutti i bio-blogger sono benvenuti

D. A chi mando il mio post dopo che l’ho scritto?
R. I contributi al Carnevale vanno inviati a Stefano Dalla Casa, uno degli autori di Oggiscienza, a questo indirizzo
D. Entro quando posso mandare la mia candidatura per partecipare?
R. Possibilmente entro il 5 Dicembre

D. Entro quando posso mandare il mio post per l’inclusione nella rassegna del Carnevale?
R. Entro e non oltre il 10 Dicembre, per dare tempo ad Andrea di leggere il post e recensirlo nella rassegna. Ritardi nell’invio del post potrebbero portare all’esclusione dal Carnevale

D. Ho una domanda sul Carnevale e vorrei discuterne in privato, con chi posso parlarne?
R. Puoi rivolgerti ad uno qualsiasi (o a tutti e tre in CC) del comitato direttivo, Livio Leoni, Marco Ferrari o Lisa Signorile

IMMUNOCITOCHIMICA.

 Esistono varie tecniche che permettono di evidenziare molecole di nostro interesse. Una di queste è l'evidenziazione immunocitochimica. E' un particolare tipo di tecnica che si basa su proteine del siero del sangue note come immunoglobuline, conosciute comunemente con il nome di anticorpi, che sono prodotti dai linfociti B dei vertebrati.

LA FORMAZIONE DEL PROCESSO ACROSOMICO.

 Nel post precedente avevamo iniziato a parlare di fecondazione e accennato ad alcuni meccanismi che permettono il riconoscimento tra spermatozoo e cellula uovo. Stadio successivo all'attrazione chemiotattica nello spermatozoo, è la formazione del processo acrosomico dello spermatozoo. Prenderemo come organismo modello sempre il riccio di mare.