Il western blotting è una metodica analoga al southern e all'nothern blotting usata per rilevare una proteina specifica in una miscela complessa che vogliamo analizzare.
- è un test particolarmente sensibile ed efficace.
- svantaggi: è molto costoso e poco pratico da applicare
Per prima cosa si deve ottenere un campione della proteina di nostro interesse che si desidera analizzare, ciò lo si può ottnere ad esempio da campioni di cellule. Le cellule vengono opportunamente lisate in modo tale da ottenere il contenuto proteico. In seguito si effettua un elettroforesi su gel in modo tale che le proteine vengano separate in base alle dimensioni. Le proteine devono essere trasferite dal gel su una membrana di nitrocellulosa usando l'elettricità, il trasferimento non avviene per capillarità come nel caso del southern o del nothern. Questa membrana può quindi essere utilizzata per sondare le proteine di interesse utilizzando un anticorpo.
L'anticorpo ci serve per rilevare la proteina di nostro interesse tra le migliaia di proteine sul gel!
E' possibile visualizzare la proteina direttamente sulla nitrocellulosa usando un metodo colorimetrico.
In seguito la separazione elettroforetica delle proteine è resa possibile sotto l'influenza di un campo elettrico applicato. La migrazione delle proteine avviene in base al loro peso molecolare; e non si esplica per capillarità come nel nothern o southern blot. Può essere usato l'SDS per denaturare le proteine.
Con il western blot qualsiasi campione di proteine proveniente da tessuti o cellule e le proteine ricombinanti sintetizzate in vitro. L'efficacia del processo dipende anche dal tipo di anticorpo che andiamo ad utilizzare per la proteina di nostro interesse e quanto è specifico per essa. Sono fondamentali ai fini della riuscita di questa tecnica, in quanto l'anticorpo ci permette di distinguere tra le migliaia di proteine presenti nel campione di analisi quella che ci interessa.
Come si può vedere nel disegno illustrativo sotto, nel primo passaggio otteniamo le proteine di nostro interesse, le possiamo prelevare da campioni di cellule per esempio. Le cellule vengono lisate in modo tale da rilasciare le proteine. In seguito le proteine raccolte vengono fatte "correre" sul gel tramite elettroforesi, in modo tale da separarle in base al peso molecolare. Le proteine una volta separate saranno trasferite su una membrana tramite l'utilizzo di elettricità.
Altro elemento essenziale per la riuscita del western blot è la presenza di anticorpi che servirà per rilevare la proteina che ci serve tra le migliaia presenti. Dopo aver utilizzato l'anticorpo primario che ha legato le proteine di nostro interesse, si utilizza in seguito un anticorpo secondario in grado di poter rilevare il primo. Si viene a creare un vero e proprio sandwich (proteina-anticorpo primario-anticorpo secondario). L'anticorpo secondario ha ad esso associato un enzima, in grado di poter catalizzare una reazione in cui un substrato specifico viene poi convertito in un prodotto luminoso.
La luce rilasciata da questo composto viene evidenziata può essere evidenziata come una macchia sulla pellicola; macchia che ci permette di individuare la proteina che stiamo ricercando.
Ben spiegato senza dubbio...quello che volevo chiedere ora è: una volta che noi otteniamo la proteina di interesse o l'rna, dna con le tecniche di Southern, Northern e Western...quali sono le applicazioni pratiche? Ovvero si possono poi estrarre dalla matrice quelle marcate che vogliamo studiare?
RispondiEliminaScusa per il ritardo con cui rispondo.
RispondiEliminaTi rispondo in ordine: le applicazioni pratiche per il southern sono varie, il rilevare la presenza di DNA di interesse significa che può essere fondamentale l'utilizzo di tale tecnica per rilevare la presenza o l'assenza di specifici geni o frammenti genici, quindi in seguito studiarne la struttura, la sequenza. Ma non solo la si può utilizzare anche per diagnosi di malattie ereditarie (fibrosi cistica ad esempio ecc...)mappatura del genoma ecc... Tali tecniche quindi possono essere ampiamente sfruttate per questo tipo di analisi, nel caso del nothern si vuole individuare l'rna di interesse e tale tecnica potrebbe essere molto utile per individuare in quali tessuti un particolare rna viene espresso oppure come varia la sua espressione. In ogni caso una volta che abbiamo individuato il dna, la proteina di interesse o l'rna non si procede alla sua singola estrazione dalla nitrocellulosa.
La membrana può essere disibridata, quindi la sonda (che ricordiamolo è sequenza omologa contenente isotopi radioattivi rilevabili tramite autoradiografia) può essere rimossa, tramite particolare lavaggio, ad esempio facendo bollire la membrana in acqua distillata e usando SDS.
Cercherò al più presto di scrivre un post sulle tecniche di laboratorio volte ad individuare una particolare sequenza nucleotidica ecc...e che vede protagoniste queste tecniche.Spero di poterti essere stato utile in qualche modo.
Alla prossima.