pUC8 E I VETTORI FAGICI.

Continuiamo il discorso sui vettori di clonaggio parlando del vettore pUC8 e dei vettori fagici. Il vettore pUC8 a differenza del pBR322 di cui abbiamo parlato nel clonaggio del DNA, presenta un gene per la resistenza all'ampicillina e il gene lac z che codifica per l'enzima beta galattosidasi. La presenza nelle cellule di molecole di beta-galattosidasi funzionali può essere saggiata mediante un test istochimico utilizzando un composto noto come x-gal (5-bromo-4-cloro-3-indol-beta-galattopiranoside) che l'enzima è in grado di convertire in un prodotto di colore blu. Il gene lac Z contiene al suo interno un raggruppamento di siti di restrizione unici, e come per il vettore pBR322 l'inserimento di un frammento di DNA all'interno di questo gene ne causa l'inattivazione, e di conseguenza perdita dell'attività beta galattosidasica. I ricombinanti possono, essere, quindi distinti dai non ricombinanti piastrando le cellule su un terreno contenente X-gal e ampicillina tutte le colonie contenenti enzimi beta galttosidasi funzionali codificati dal gene lac Z non interrotti saranno di colore blu. Le colonie bianche invece hanno geni lacZ non funzionali con attività beta-galalattosidasica nulla. Loro sono i ricombinanti.

I VETTORI FAGICI

I batteriofagi dell'E.Coli sono stati utilizzati fin dall'inizio dell'avvento della tecnologia del DNA ricombinante. Il motivo? Bisogna ricercarlo nei vettori pUC8 e pBR322 e nella loro incapacità nell'ospitare inserti di DNA di dimensioni maggiori alle 10 kb. Infatti frammenti più grandi possono andare incontro a riarrangiamenti o interferire con il sistema di replicazione del plasmide causando la conseguente perdita dei frammenti di DNA di nostro interesse. I primi esperimenti su come ottenere dei vettori in grado di ospitare dei frammenti di dimensioni maggiori sono stati effettuati sul batteriofago lambda.
Il ciclo di infezione di lambda è simile a quello dei fagi T2. Ci sta una differenza però; oltre a eseguire un ciclo di infezione litico, il genoma del lambda ha la capacità di integrarsi con il cromosoma batterico e li rimanere quiescente per molte generazioni ed essere replicato insieme ad esso ogni volta che la cellula si divide. In questo caso si parla di ciclo di infezione lisogeno. Il genoma del lambda è lungo circa 45 Kb ma parte della sua sequenza nucleotidica, circa 15 kb è facoltativa nel senso che contiene solo geni che sono necessari all'integrazione del fago nel cromosoma dell'E.Coli. Questi frammenti possono quindi essere eliminati senza alterare la capacità del fago di infettare i batteri e dirigere la sintesi di nuove particelle lambda tramite il ciclo litico.

 

Sono stati sviluppati due tipi di vettori:
1) I vettori di inserzione, in cui una parte o tutto il DNA è facoltativo ed è stato rimosso ed è stato introdotto in un sito di restrizione unico.
2) I vettori di sostituzione in cui il DNA facoltativo è contenuto in un frammento di riempimento (STUFFER) fiancheggiato da una coppia di siti di restrizione che viene rimpiazzato quando il DNA da clonare è ligato al vettore.
Il genoma del Lambda è lineare le due estremità delle molecolehanno sporgenze a singolo filamento di 12 nucleotidi chiamate siti cos che hanno sequenze complementarie possono quindi appaiarsi tra di loro. SI può quindi ottenere una molecola di DNA circolare che può essere manipolato allo stesso modo del plasmide e poi inserito nell' E.Coli tramite il processo di trasfezione.
In alternativa si può utilizzare un altro metodo di inserimento più efficiente che prende il nome di impacchettamento in vitro. Questa procedura inizia con la versione lineare del frammento del vettore di clonaggio. La digestione taglia la molecola in due segmenti, il braccio destro e il braccio sinistro ciascuno con un sito cos ad entrambe le estremità. La ligazione è eseguita in maniera tale da produrre dei concatenameri in cui i diversi frammenti di DNA si trovano nell'ordino braccio sinistro-nuovo DNA-braccio destro. I concatenameri in seguito vengono aggiunti ad una miscela di impacchettamento in vitro che contiene tutte le proteine necessarie per formare una particella di fago lambda. Queste particelle fagiche si appaiano tra di loro sponteneamente e incorporano al loro interno qualsiasi DNA di dimensioni comprese tra le 37 e 52 kb fiancheggiato da siti cos.

 La miscela di impacchettamento taglia i concatenameri nelle singole combinazioni braccio sinistro nuovo dna braccio destroe costruisce intorno a loro le particelle fagiche. A questo punto si mescolano i fagi e le cellule di E.coli e la natura farà il resto, attraverso il processo di infezione il vettore trasporterà all'interno del batterio. Dopo l'infezione le cellule vengono piastrate su un terreno di Agar, l'obiettivo è di produrre uno strato continuo di batteri su tutta la superficie dell'agar, i batteri che sono stai infettati li riconosciamo perchè muoiono dopo cira 20 minuti a causa del lambda che causerà terminato il suo ciclo di infeione altre particelle virali tramite la distruzione del batterio. I fagi che vengono rilasciati nel terreno di colura infettano nuovi batteri e il cilco si ripete, il risulatato finale è la formazione di una zona trasparente chiamata placca. Con alcuni vettori lambda tutte le placche sono costituiti da fagi ricombinanti, poichè la ligazione delle due braccia senza inserimento del nuovo dna produce dei frammenti troppo piccoli affinchè possano essere impacchettate.