ISTONI E DNA

Il genoma contenuto nel nucleo delle cellule eucariote è ripartito in molecole lineari di DNA, molecole che in determinati stadi del ciclo cellulare si condensano fino ad essere impacchettate in modo tale da formare i cosidetti cromosomi.

In tutti gli eucarioti studiati i cromosomi sono come minimo presenti in numero di due, e la presenza di DNA lineare sembra essere una caratteristica comune a tutti gli eucarioti. Unica differenza è costituita dal diverso numero di cromosomi a seconda delle specie che prendiamo in considerazione, che non sembra assolutamente essere correlato alla complessità dell'organismo che prendiamo in considerazione, ne alle sue dimensioni.

Per fare un esempio:  il lievito (Saccharomyces cerevisiae) un fungo, possiede un numero di cromosomi quattro volte più grande del moscerino della frutta (Drosophila melanogaster) e le dimensioni di questi organismi sono nettamente differenti.

Il numero e la forma dei cromosomi varia da specie a specie.

Un ricercatore o un laborista analizza il contenuto cromosomico di una cellula nel momento in cui i cromosomi sono più visibili. Ciò avviene nello stadio cellulare noto come metafase, dove i singoli cromosomi si sono duplicati e condensati perdendo la loro iniziale struttura filamentosa e assumendo l'aspetto di strutture a bastoncello.

Ciasuna struttura a bastoncello è costituita da due metà identiche definite cromatidi fratelli, uniti tra di loro a livello del centromero.

I cromosomi sono molto più piccoli delle molecole delle DNA che contengono, infatti per permettere alla molecola di DNA di entare all'interno della regione del nucleo è fondamentale che esista un sistema di impacchettamento altamente organizzato che permetta a tale molecola di poter essere inserita in tale regione. L'impacchettamento del DNA e il suo grado di avvolgimento, svolgono un ruolo di primaria importanza anche nell'espressione genica, ma di questo parleremo in seguito.

All'inizio degli anni 70 furono fatte le prime scoperte riguardanti i meccanismi che portavano il DNA ad essere impacchettato.

Era già noto attraverso vari studi e osservazioni che il DNA era avvolto attorno da un particolare gruppo di proteine note come istoni ma poco si sapeva a riguardo dell'associazione tra DNA e tali proteine.

Esperimenti con le nucleasi.

Attorno agli anni 70 furono eseguiti esperimenti di protezione da nucleasi sulla cromatina (approfondiremo meglio, ma la possiamo definire come complesso DNA-istoni) estratta dalle cellule. Il complesso DNA-proteine venne trattato con enzima noto come nucleasi il quale ha la capacità di tagliare il DNA in posizioni che non sono protette dal legame con una proteina.  I frammenti risultanti dalla digestione con nucleasi  permisero di definire il posizionamento dei complessi proteici sulla molecola di DNA.

Tali scoperte in seguito sono state supplementate da micrografie elettroniche di cromatina purificata che hanno permesso di visualizzare la spaziatura regolare che era stata dedotta dagli esperimenti di protezione sotto forma di perle proteiche su un filo di DNA. Un ulteriore analisi biochimica ha indicato che ciascuna perla, definita nucleosoma, contiene otto molecole proteiche istoniche, due per ogni istone (H2A, H2B, H3, H4). Studi più approfonditi che hanno in seguito permesso di comprendere come tale complesso di proteine era strutturalmente organizzato ha mostrato che queste otto proteine costituiscono il nucleo, detto anche ottamero, di forma che ricorda vagamente quella di un barile con il DNA che è avvolto intorno a tale struttura proteica due volte.

Come è costituito questo complesso sistema di impacchettamento del DNA?

Bisogna comprenderlo prima di poter comprendere cosa è un genoma, prima di pensare come funziona un genoma, perchè il grado di impacchettamento del DNA, influisce notevolmente sulla lettura delle informazioni contenute nelle sequenze nucleotidiche da parte della cellula, sull'espressione dei geni!

Le proteine istoniche svolgono un ruolo importante nell'avvolgere il DNA, l'insieme di proteine istoniche e di DNA forma il nucleosoma.

Ogni nucleosoma è costituto da otto proteine istoniche, due per istone, quindi abbiamo due H2A, H2B, H3, H4.

Molti studi hanno dimostrato che questo gruppo di otto proteine, definito all'occorrenza ottamero, deve essere pensato come una specie di barile che avvolge due volte la molecola di DNA.

Alla particella nucleosomica sono associate dalle 140 alle 150 bp circa di DNA e ciascun nucleosoma risulta separato da un altro da circa 50-70 bp di DNA definito "linker".

VI sono anche altri istoni definiti linker; nei vertebrati comprendono gli istoni H1a-e, H1, H1t e H5.

A ciascun nucleosoma si trova attaccato un istone linker e porta alla formazione del cosidetto cromatosoma, ma il suo posizionamento non è chiarissimo.

Sembra che l'istone linker svolga un ruolo importante nel tenere ben legato il DNA al nucleosoma impedendogli di staccarsi da esso. Sembra inoltre che l'istone linker non sia associato, almeno non in tutti gli organismi, direttamente al complesso del nucleosoma, ma che sia interposto tra l'ottamero e il DNA.

Prima avevamo accennato alla formazione di una specie di filo di perle causato dall'associazione degli istoni e del DNA; non si deve fare l'errore di pensare che tale struttura rappresenti il DNA impacchettato, infatti la struttura a filo di perla sembra trovarsi solo di rado nei nuclei viventi.

...Vari sono stati i modelli utilizzati per spiere l'avvolgimento della fibra cromatinica a 30 nm, il modello che trova più consenso a riguardo è la struttura a solenoide. A permettere tale organizzazione potrebbero essere le interazioni tra il DNA linker oppure i punti di legame potrebbero coivolgere i nuclei dell'ottamero, gli istoni del core" le cui code proteiche si estendono al di fuori del nucleosoma Ipotesi quest'ultima molto interessante in quanto modicazioni chimiche di tali code causavano l'apertura della fibra di 30 nm, permettendo l'attivizone dei geni in essa contenuti.

Gli istoni sono proteie basiche.

Gli istoni sono le proteine più abbondanti associate ai cromosomi; il loro ruolo dunque è quello di legarsi al DNA cromosomico carico negativamente, sono proteine basiche contenenti molto ricche di amminoacidi basici arginina e lisina i quali nell'insieme rappresentano circa il 25% degli amminoacidi che compongono le proteine istoniche (una percentuale più alta di quella che si osserva nelle altre proteine).

Tramite numerosi studi si è riscontrato un alto grado di somiglianza tra le sequenze amminacidiche deli istoni H2A, H2B, H3, H4, ciò indica che gli istoni svolgono lo stesso ruolo di base nell'organizzazione del DNA in tutti gli eucarioti.

Tutti gli istoni sono modificat iattraverso il legame covalente di alcune unità ai gruppi liberi di alcuni amminoacidi. Le modificazioni più comuni sono le acetilazioni, metilazioni, fosforilazione, ubiquitazione, ADP-ribosilazione.

Tutte le modificazioni interessano sempre residui interni delle proteine istoniche e sono transitorie, si verificano solo in determinati momenti del ciclo cellulare. Tali modificazioni nel cambiare la conformazione delle proteine istoniche permetteranno o impediranno a seconda dei casi la lettura dell'informazione genetica e il suo utilizzo da parte della cellula quindi giocando un ruolo di fondamentale importanza nel processo della trascrizione.

I nucleosomi, complessi proteici importanti nell'organizzazione della cromatina.

Precedentemente abbiamo accennato al fatto che il DNA viene avvolto e compattato all'interno della regione del nucleo, questo ripiegamento richiede diversi livelli di ripiegamento altamente organizzato.

Il DNA viene legato attorno agli istoni, assumendo una conformazione che ricorda da vicino quella di una "collana di perle". I granuli che compongono questa collana sono complessi di istoni e DNA. Il granulo e il tratto di DNA di conessione con il granulo vicino formano il nucleosoma, l'unità fondamentale dell'organizzazione su cui si basa la complessità struttural di ordine superiore della cromatina. Il granulo costituito da ogni nucleosoma contiene otto molecole istoniche, due copie ciascuna degli istoni H2A, H2B, H3, H4. I nucleosomi costituiscono una unità ripetitiva formata da circa 200 coppie di basi di cui 146 circa sono legate strettamente al nucleo istonico; il restante costituisce il linker, il DNA di collegamento.

Il ripiegamento del DNA che porta alla formazione della struttura a solenoide, è una conformazione che viene assunta dal DNA parzialmente disavvolto (superavvolgimento negativo). Il DNA si deve associarsi in maniera molto stretta ai nuclei istonici, questo avvolgimento richiede la rimozione di un giro dell'elica per permettere rotazioni molto strette.

E'stato osservato in vitro che quando il nucleo proteico di un nucleosoma viene legato da un DNA chiuso in forma rilassata il legame induce un superavvolgimento negativo.

Il legame del DNA a questo complesso, con tale modalità di avvolgimento non causa danni alla struttura della doppia elica. La formazione di una superelica a solenoide negativa deve essere accompagnata da un superavvolgimento positivo compensativo in un altro punto del DNA non legato (vedi immagine sotto).

Enzimi come le topoisomerasi eucariotiche possono determinare il rilassamento della superelica positiva; il rilassamento lascia intatto l'avvolgimento supernegativo rappresentato dal DNA associato al nucleo istonico determinando una riduzione nel numero di legame.

Altro fattore importante che permette il legame del DNA agli istoni  è la sequenza di DNA coinvolta nel legame. Il DNA non si lega a caso sul nucleo istonico, i nucleosomi sono localizzati in particolari posizioni.

Il motivo di uno specifico posizionamento sembra risiedeere nel fatto che i nucleosomi si formano dove i sono abbondanti appaiamenti di A=T. SI è inoltre osservato che lo stretto avvolgimento del DNA attorno al nucleo istonico richiede anche una compressione della scalanatura minore dell'elica in questi punti, le regioni ricchi di A=T sembrano facilitare questa compressione.

L'avvolgimento del DNA e le strutture di ordine superiore.

L'avvolgimento è fondamentale per compattare il DNA dunque; l'avvolgimento attorno al nucleosoma rende il DNA più compatto di circa sette volte. Nei cromosomi isolati gli stessi nucleosomi appaiono ulteriormente organizzati in modo da formare ciò che si pò per semplicità deginire una fibra di 30 nm.

La fibra da 30 nm è lo stadio in cui si trova la cromatina attiva in interfase (periodo compreso fra due divisioni cellulari), cioè la cromatina che viene trascritta.

L'organizzazione della fibra a 30 nm non si estende per tutta la lunghezza del cromosoma, ma è inframezzata da regioni che interagiscono con proteine non istoniche anch'esse legate al DNA in modo sequenza specifico. Poche righe sopra è stato accennato che la fibra a 30 nm è lo stadio in cui si trova la cromatina in interfase periodo durante il quale avviene un intensa trascrizione delle informazioni contenute nei geni; è stato osservato che le regioni particolarmente ricche di geni e sottoposte a trascrizione presentano uno stato molto meno ordinato con una scarsa presenza di istone linker H1. La fibra a 30 nm fornisce al DNA una compattazione di circa 100 volte. Il livello superiore di compattezza alla fibra da 30 nm non è conosciuto del tutto ma volendo potremmo seguire il seguente elenco e parlare di:

1)fibra da 300 nm di diametro o fibra ad ansa, la cromatina si ripiega ulteriormente su se stessa grazie anche all'aiuto di altre proteine.

2) fibra da 700 nm di diametro, la cromatina si superavvolge, è il diametro dei singoli cromatidi.

3) fibra da 1400 nm di diametro, è il livello di condensazione massimo, quello dei cromosomi mitotici

Da varie osservazioni sembra inoltre che alcune regioni del DNA si associno con una impalcatura nucleare, tali regioni sono separate da anse di DNA che contengono migliaia di coppie di basi.

Nell'immagine sotto si può osservare un croosoma umano parzialmente srotolato che mette in evidenza le numerose anse di DNA attaccate ad una struttura simile ad una impalcatura.