IMMUNOCITOCHIMICA.

 Esistono varie tecniche che permettono di evidenziare molecole di nostro interesse. Una di queste è l'evidenziazione immunocitochimica. E' un particolare tipo di tecnica che si basa su proteine del siero del sangue note come immunoglobuline, conosciute comunemente con il nome di anticorpi, che sono prodotti dai linfociti B dei vertebrati.

In questo disegno il problema è stabilire se un antigene è presente nel campione A o B, e se l'antigene è presente nel nucleo o nel citoplasma. L'anticorpo primario è diretto contro l'antigene voluto, interagisce con la sezione di tessuto. L'anticorpo secondario associato ad un colorante è diretto contro l'anticorpo primario. La distribuzione del coniugto sul tessuto mostrala localizzazione precisa dell'antigene che in questo esempio è localizzato nel citoplasma della cellula B.

Gli anticorpi hanno una grande prerogativa funzionale, sono in grado di legarsi ad un particolare epitopo, osemplicemente una molecola estranea chiamata antigene. Una caratteristica degli può avere diversi epitopi e può così reagire con diversi anticorpi. Gli anticorpi definiti monoclonali si preaprano dal sangue di mammiferi che vengono immunizzati iniettandoli con l'antigene di interesse. In genere, l'ospite immunizzato è un mammifero, generalmente un coniglio, da cui viene prelevato del sangue ad intervalli di tempo regolari, per controllare la presenza di anticorpi di nostro interesse. Il siero ricavato dallo stesso animale viene definito siero preimmunee viene utilizzato come controllo della reazione. Questa preparazione fornisce un anticorpo primario che si lega selettivamente all'antigene di nostro interesse. Per rendere visibile il legame tra l'anticorpo primario e l'antigene, e quindi per la localizzazione dell'antrifene, l'anticorpo viene coniugato con un colorante, generalemnte un colorante fluorescente o un fluorocromo. Questo però porta al riconoscimento di 1/1 molecola, che talvolta può dare colorazione poco evidente (metodo diretto), per tale motivo si ricorre più frequetemente al metodo indiretto mediante l'introduzione di anticorpi definiti secondari; legati ad un fluorocromo preparato in una specie diversa e diretto contro l'anticorpo primario. Gli anticorpi secondari disponibili in commercio sono ottenuti da alcuni animali, ad esempio suini e sono dirette contro tutte le immunoglobuline di coniglio. In questo caso sono gli anticorpi secondari ad essere coniugati con coloranti come fluorocromi o enzimi che provocano una reazione colorata,tipo perossidasi o fosfatasi. Gli anticorpi primari e secondari si usano in sequenza, il primo localizza l'antigene, il secondo localizza l'antigene primario e lo rende visibile. Su ogni campione su cui si vuole localizzare l'antigenesi pone una goccia di anticorpo primario opportunamente diluito e si lascia incubare finchè l'anticorpo non si lega all'antigene. a questo punto l'anticorpo primario in eccesso viene lavato via mediante lavaggi con aposite soluzioni. L'anticorpo secondario viene poi aggiunto sul campione, lasciato incubare pe riltempo necessario all'adesione all'immunoglobulina primaria. Dopo il lavaggio il campione viene montato in un mezzo adeguato e osservato al microscopio. la colorazione o la fluorescenza osservata al microscopio, mostreranno la localizzazione dell'anticorpo secondario che è legata quello primario che p legato all'antigene. Il controllo effettuato con il siero preimmune al posto dell'anticorpo primario, permette di visualizzare eventuali legami aspecifici, e quindi di eliminarli dall'osservazione