RNA INTERFERENCE.

(Ho modificato il post sull'RNA interference, rendendolo molto più completo).

L'RNA interference (interferenza dell'RNA) fu scoperto per la prima volta in un verme nematode (Caenorhabditis elegans). Fu osservato  che l'RNA a doppio filamento (dsRNA, double stranded RNA) causava il silenziamento genico in maniera sequenza-specifica. I ricercatori avevano pensato per molto tempo che l'RNA sarebbe stato uno strumento perfetto per il controllo dell'espressione genica, dal momento che la giusta sequenza di RNA dovrebbe legare il DNA e interferire con la sua trascrizione. Mentre si studiava l'efficienza dell'RNA antisenso come soppressore dell'espressione genica, fu scoperto che il dsRNA era molto più efficiente nello spegnere la trascrizione di un gene.

Nelle nostre cellule la presenza di RNA a doppia elica può rappresentare un bel problema. Nonostante nelle cellule siano presenti gli RNA transfer e i ribosomi, che contengono alcuni tratti definiti a forcina e quindi a doppia elica, la maggior parte del nostro RNA, ed in particolar modo l'RNA messaggero, è a singola catena. Molti virus, invece, formano lunghi tratti di RNA a doppia elica quando duplicano il loro genoma. Se le nostre cellule trovano RNA a doppia elica, interpretano il fatto come un'infezione virale e producono una risposta che spesso porta alla morte dell'intera cellula. Le piante e gli animali, però, possiedono anche altre difese più mirate che attaccano direttamente l'RNA virale, chiamate interferenze di RNA.

 Dalla sua scoperta è stato osservato che il meccanismo dell'RNA interference era presente anche nelle cellule delle piante, nelle quali costituisce un modo per degradare gli rna virali. la sua funzione in seguito è stata osservata anche nella drosophila e nei mammiferi. Al momento si ritiene che l'RNAi sia un meccanismo regolatore naturale che controlla l'espressione genica. Potrebbe anche essere un meccanismo di protezione  nei confronti degli oncogeni che sintetizzano prodotti genici dannosi  in quantità eccessiva.

Produrre l'interferenza

COme mostrato nell'immagina a inizio pagina l'interferenza di RNA inizia quando si presenta una lunga catena a doppia elica di RNA come quella prodotta dai virus in replicazione. Un enzima  appartenente alla classe delle RNAsi III noto come Dicer (che frammenta), mostrato qui in alto a destra in blu (file PDB 2ffl),si lega alla sequenza di dsRNA tagliando la catena in piccoli frammenti chiamati breve RNA interferente (siRNA), uno di questi è mostrato in alto a sinistra (file PDB 2f8s). I siRNA sono lunghi circa 21 paia di basi, ma le due catene sono tagliate in modo asimmetrico: 19 nucleotidi sono perfettamente accoppiati mentre due nucleotidi sporgono da ognuna delle due estremità 3'. Queste caratteristiche permettono di riconoscere facilmente i siRNA. Sembra che un ruolo di fondamentale importanza nell'enzima Dicer, sia svolto dalla particolare disposizione dei quattro ioni manganese, evidenziati in magenta nella struttura. Si pensa che siano proprio questi ad operare il taglio asimmetrico nella catena di RNA a doppia elica creando così le sporgenze.

Il frammento ottenuto dall'azione catalizzata dalla proteina Dicer si associa ad un complesso enzimatico denominato RISC (RNA-interference silencing complex, complesso silenziatore della RNAi).

L'RNA a doppio filamento viene aperto, probabilmente da una elicasi: solo il filamento di RNA antisenso rimane associato a RISC, mentre il filamento senso viene degradato.

La RISC si lega ad un sequenza complementare di un frammento di RNA messaggero  degradandolo.

Perchè ciò avvenga è ancora oggi oggetto di studio. Probabilmente una RNA polimerasi endogena riesce in qualche modo a sentire che un particolare RNA messaggero venga fabbricato in eccesso e  attraverso le varie reazioni che abbiamo descritto dare l'avvio al processo di distruzione. In fondo se ci pensiamo bene è una logica che potrebb essere applicata anche contro i virus. Negli ultimi anni sono sorte tante industrie che hanno costruito kit per l'RNAi e  dsRNA da utilizzare in laboratorio per inattivare i geni. infatt una volta conosciuta la sequenza del gene di nostro interesse l'RNA a doppio filamento può essere utilizzata per ottenere i siRNA per spegnere il gene utilizzando questi RNAi i ricercatori sono riusciti ad esempio a  mappare migliaia di geni dell'organismo C.elegans.

Proteina argonauta

Le molecole di siRNA prodotte dall'enzima Dicer, vengono raccolte anche da proteine note con il nome di Argonauta e utilizzate per distruggere ogni altro RNA virale che si trovino nelle vicinanze. La proteina Argonauta, mostrata qui a fianco in basso (file PDB 1u04) lega su di sè una sola delle due catene del siRNA e cerca un RNA messaggero che si appai con questa. Se lo trova, lo idrolizza, cioè lo distrugge. In questo modo la cellula rimuove ogni traccia di RNA messaggero che corrisponda alla sequenza della doppia elica di RNA attaccata all'inizio dall'enzima Dicer.

Curiosità: la proteina Argonauta è stata scoperta per la prima volta in una pianta mutante che aveva una forma a spirale simile a quella della conchiglia di Nautilus, un cefalopode che gli inglesi chiamano Argonauta.

Quanti RNA...

Negli anni trascorsi dalla scoperta dell'interferenza dell'RNA, i ricercatori hanno trovato che questo processo è molto più comune di quanto ci si aspettasse all'inizio e che i piccoli frammenti di RNA svolgono molti ruoli funzionali. Una classe di molecole simili, chiamate microRNA, viene creata nel nucleo a partire dal normale RNA della cellula. Anche questi microRNA vengono creati da enzimi Dicer e sono usati per modulare l'attività del nostro normale RNA messaggero. Cercano un RNA messaggero con una sequenza complementare, vi si legano e quindi ne bloccano il funzionamento. I microRNA si accoppiano anche con sequenze complementari del DNA, in questo modo modificano le proprietà dei cromosomi cambiando il livello di metilazione o di legame con gli istoni.

Nella ricerca...

Gli scienziati hanno imparato ad utilizzare la tecnica dell'RNA interferente per distruggere specifiche sequenze di RNA nelle cellule animali e vegetali. Infatti sfruttando questo processo i ricercatori sono riusciti a sintetizzare sequenze artificiali di RNA interferente che, inserite nella cellula, possono distruggere qualsiasi RNA si voglia disattivare. COme accennato prima questa tecnica percmette di studiare i geni e quale possa essere la loro funzionalità. Ad esempio con l'RNAi si distrugge la maggior parte dell'RNA messaggero che quel gene produce usando un RNA interferente che possa legarsi allo specifico mRNA, in questo modo si arresta quasi completamente la produzione della proteina che viene codificata da quel gene e si osservano le conseguenze. Alcuni ricercatori stanno provando ad usare queste piccole molecole di RNA per combattere malattie, per esempio disattivando alcuni geni legati al cancro.

Strategie dei virus.

I virus però hanno molti assi nella manica e raramente restano senza far niente quando vengono attaccati. I virus hanno elaborato diverse strategie per reagire all'RNA interference. La proteina mostrata qui (file PDB 1r9f) è una proteina soppressore prodotta dal virus del rachitismo cespuglioso del pomodoro. Si lega ai siRNA e ne impedisce la normale funzione di distruggere l'RNA messaggero virale. Notate come la proteina (in blu) si comporti come un calibro, sovrapponendosi alle due estremità del siRNA (in arancione e rosso). In questo modo individua e blocca solo piccoli frammenti di RNA che hanno esattamente la lunghezza di un siRNA.

Uno sguardo alla struttura...

Le molecole di siRNA prodotte dall'enzima Dicer sono facili da riconoscere: hanno tutte la stessa lunghezza di 21 paia di basi e hanno un'insolita coda di due nucleotidi che sporge da ciascuna estremità 3'. La struttura mostrata qui sopra in azzurro (file PDB 1si3), è il dominio PAZ usato da molte proteine per riconoscere le due terminazioni del siRNA. Nella proteina è legato un breve tratto di siRNA rappresentato con piccole sfere colorate. Notate, in alto a sinistra, come le due basi sporgenti si legano all'interno di una piccola tasca della proteina, mentre la base terminale della catena più corta, sulla destra, si appoggia esattamente sotto una sporgenza della proteina.

Ecco un filmato del meccanismo della rna interference direttamente dal sito di nature (meccanismo rna interference

Fonti: PDB (protein data bank);  Nature.