giovedì 22 aprile 2010

RT PCR: REVERSE TRANSCRIPTASE POLYMERASE CHAIN REACTION



E' una metodica di analisi dei trascritti mediante l'abbinamento dell'azione della trascrittasi inversa con amplificazione tramite pcr. La sigla reverse transcriptase sta per trascrittasi inversa. Si prepara del cDNA (ovvero una molecola di DNA sintetizzato sullo stampo di una molecola di mRNA) sintetizzato da molecole di RNA estratto da cellule da studiare e si amplifica selettivamente quello che interessa. L'mRNA viene incubato con un oligonucleotide formato solo da timine oligo d+t, il quale si appaierà con la sequenza di poliA presente all'estremità 3' dell'mRNA. L'oligo dt funge da innesco per la sintesi di un filamento di DNA ad opera della trascrittasi inversa. SI ottiene, quindi un duplex ibrido di mRNA-cDNA.
L'mRNA può essere eliminato per trattamento con alcali o con la ribonucleasi. rimuovendo l'RNA rimane il cDNA neosintetizzato o singolo filamento usando un secondo oligonucleotide specifico come innesco ed il primo filamento di cDNA come stampo. La molecola di cDNA così ottenuta può essere amplfificata mediante PCR usando gli stessi 2 oligonucleotidi come innsesco (oligo dt e primer specifico). In questa maniera si dovrebbe avere una amplificazione assolutamente specifica e quindi in definitiva una maggiore sensibilità.

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